[發明專利]一種自發光煙草及轉基因方法

在審

• 申請號: 201710120673.4
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN108522290A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 段康;張晨;趙娟;生承曄;張業勝;王文;董揚
• 申請（專利權）人: 云南納博生物科技有限公司
• 主分類號: A01H5/00
• 分類號: A01H5/00;C12N15/82;A01H4/00;A01H6/82
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.一種自發光煙草，其特征在于，所述自發光煙草通過發光基因與質粒載體構建發光基因-質體載體表達載體，發光基因-質體載體再通過質體轉基因技術導入到煙草葉片中，煙草葉片通過組織培養得到。

2.如權利要求1所述的自發光煙草，其特征在于，所述質粒載體為p-DK6質粒載體，堿基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如權利要求1所述的自發光煙草，其特征在于，所述發光基因為LUX基因。

4.一種自發光煙草的轉基因方法，其特征在于，所述轉基因方法操作如下：通過基因合成得到發光基因LUX序列，并進行PCR擴增；然后采用NcoI限制性內切酶和XbaI限制性內切酶切p-DK6質粒載體，獲得線性化p-DK6質粒載體，將發光基因LUX連接到線性化p-DK6質粒載體上，獲得發光基因-質體載體，采用基因槍將發光基因-質體載體轟擊導入經高滲培養后的煙草葉片中；

導入有發光基因-質體載體的煙草葉片經過恢復培養基培養后，然后在篩選培養基中進行篩選培養，得到陽性愈傷組織，陽性愈傷組織繼續繼代篩選培養獲得同質化100％的愈傷組織，進而在生根培養基中誘導成苗得到自發光煙草。

5.如權利要求4所述的自發光煙草的轉基因方法，其特征在于，所述基因槍轟擊煙草葉片的條件如下：基因槍氦氣壓至1050～1150psi，轟擊距離為6cm或9cm。

6.如權利要求4所述的自發光煙草的轉基因方法，其特征在于，所述發光基因LUX進行PCR擴增時的引物對如下：

前引物primer-F：AGGGAGGGATCCATGGGAATACCAAAGGAGATTAC；

后引物primer-R：TAATGTCTACTCTAGAAATATCCCTATAAATAGAAC。

7.如權利要求4所述的自發光煙草的轉基因方法，其特征在于，所述高滲培養條件如下：高滲培養基配方為MS基礎培養基+甘露醇0.05～0.3mol/L+山梨醇0.05～0.2mol/L+蔗糖25～35g/L+瓊脂6.8～9g/L，pH5.6～6；高滲處理時間為3～5h，常溫密封放置；

所述恢復培養條件如下：恢復培養基配方為MS基礎培養基+6-BA 0.5～1.5mg·L^-1+NAA50～180ug·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1+瓊脂6.8～9g·L^-1，pH5.6～6；恢復培養為暗培養，溫度為22～26℃，培養時間為5～10天。

8.如權利要求4所述的自發光煙草的轉基因方法，其特征在于，導入有發光基因-質體載體的煙草葉片經過2～4輪篩選培養得到陽性愈傷組織；篩選條件如下：篩選培養基配方為MS基礎培養基+6-BA 0.5～1.5mg·L^-1+NAA 50～180ug·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1+瓊脂6.8～9g·L^-+壯觀霉素500～2000mg/L，pH5.6～6；

篩選培養溫度為22～26℃，光照強度為1500～2500lux，每天光照時間為12～14小時，篩選培養時間為70～85天；或者篩選培養溫度為22～26℃，光照強度為8000～11000lux，每天光照時間為14～16小時，篩選培養時間為35～45天。