[發明專利]一種確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法

在審

• 申請號: 201710120450.8
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106916841A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 李鵬鵬;張牧晗;鄒燁;孫芝蘭;孫沖;耿志明;王道營;徐為民
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;G01N33/68;G01N21/59;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙)32104
• 代理人: 曹祖良,張仕婷

技術領域

本發明涉及一種確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

熱休克蛋白Hsp12不像其他熱休克蛋白一樣保護其他蛋白免于去折疊和降解，而是結合到細胞膜上穩定細胞膜防止其發生破裂和泄漏。

熱休克蛋白(Heat shock protein，Hsp)是生物中廣泛存在的一類高度保守蛋白質，也是膜結合蛋白之一。按照分子量的大小，Hsp共分為5類，分別是Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60以及小分子蛋白。正常機體細胞內的熱休克蛋白可作為分子伴侶，參與蛋白質的跨膜轉運和折疊等。在機體處于脅迫狀態時，熱休克蛋白能提高表達與細胞內各組分如膜、蛋白質、細胞骨架元件等相互作用，維持細胞的穩定。熱休克蛋白對細胞膜的流動性、滲透性、完整性具有調控作用。在酵母細胞中，Hsp12結合到細胞膜上穩定細胞膜防止其發生破裂和泄漏；在乳酸菌中，小分子熱休克蛋白可以與細胞膜作用維持膜脂的結構和狀態。磷脂是細胞尤其是細胞膜磷脂雙分子層的重要組分，兩者間關系密切。小分子熱休克蛋白和Hsp70與磷脂的結合已有報道。Harada等用非變性PAGE檢測了Hsp70的N端ATPase功能區和C端多肽結合區能夠與酸性糖脂和磷脂結合，而與中性糖脂和磷脂則不能結合；McCallister等用超速離心的方法檢測到Hsp70的N端和C端都能結合磷脂，只是N端比C端結合的磷脂的量多。非變性PAGE和超速離心的方法常得出相反的結果，并且不能實時觀測結合的動力學和親和力。到目前為止未見過對Hsp90α結合磷脂的區域的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法，通過分段表達鴨Hsp90α蛋白，借助表面等離子共振技術實時觀測各鴨Hsp90α蛋白片段與磷脂結合的動力學和親和力，確定鴨Hsp90α蛋白與磷脂結合的區域。

本發明的技術方案，一種確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法，步驟如下：

(1)鴨Hsp90α基因及各片段基因序列的獲得：

a、鴨Hsp90α基因提取：取鴨胸肌100mg，提取總RNA，總RNA經電泳檢測，采用核酸定量分析儀測定OD_260/280比值及濃度，以1μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書進行反轉錄；反轉錄程序：37℃15min，85℃5min，4℃保存，長期保存應放于-20℃；

b、特異性引物的設計：根據北京鴨的Hsp90α基因序列設計系列基因特異性引物，包括：上游引物F，下游引物R，以及分段用特異性引物N-R、M-F、M-R、C-F和C-R；

c、PCR擴增：以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；PCR產物純化回收后連接至pCold1載體，轉化至DH5α感受態細胞，將菌液涂在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上，37℃培養過夜，然后挑取陽性單菌落進行培養，經菌落PCR及雙酶切鑒定重組質粒，對正確的重組質粒進行測序，將測序無誤的重組質粒分別轉化進入表達感受態細胞Transetta2；

(2)融合蛋白原核表達及可溶性分析：以陽性重組質粒轉化步驟(1)所得大腸桿菌Transetta2感受態細胞，挑取單菌落接種至5mL含100μg/mL氨芐的LB培養基中，37℃，200r/min震蕩培養，當菌液濃度OD₆₀₀值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.25mM，22℃，200r/min搖晃誘導過夜；用不加IPTG誘導的菌液做對照，離心收集沉淀，用PBS重懸沉淀，于超聲波細胞破碎儀上破碎4-6min，11000-13000r/min離心4-6min，分別取出上清、沉淀，加入SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，95℃加熱10min，用12％SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白是否為可溶性蛋白；

(3)重組融合蛋白的誘導表達及純化：

d、誘導表達：將步驟(2)鑒定所得能可溶性表達的菌落接種于500mL含LB培養基中進行誘導表達；4400-4600r/min離心14-16min收集菌體，用pH為7.6含有50mM的磷酸鹽，150mM的NaCl，5mM的咪唑的Binding Buffer緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎18-22min，超聲參數為：功率20％，超聲1s，間停3s、再11000-13000r/min離心28-32min，4℃收集上清，棄菌體沉淀；