[發明專利]一種確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法

在審

• 申請號: 201710120450.8
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106916841A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 李鵬鵬;張牧晗;鄒燁;孫芝蘭;孫沖;耿志明;王道營;徐為民
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;G01N33/68;G01N21/59;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙)32104
• 代理人: 曹祖良,張仕婷

1.一種確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法，其特征是步驟如下：

（1）鴨Hsp90α基因及各片段基因序列的獲得：

a、鴨Hsp90α基因提取：取鴨胸肌100mg，提取總RNA，總RNA經電泳檢測，采用核酸定量分析儀測定OD_260/280比值及濃度，以1μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書進行反轉錄；反轉錄程序：37℃ 15 min，85℃ 5min，4℃保存，長期保存應放于-20℃；

b、特異性引物的設計：根據北京鴨的Hsp90α基因序列設計系列基因特異性引物，包括：上游引物F，下游引物R，以及分段用特異性引物N-F、N-R、M-F、M-R、C-F和C-R；

c、PCR擴增：以 cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；PCR產物純化回收后連接至pCold1載體，轉化至DH5α感受態細胞，將菌液涂在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上，37℃培養過夜，然后挑取陽性單菌落進行培養，經菌落PCR及雙酶切鑒定重組質粒，對正確的重組質粒進行測序，將測序無誤的重組質粒分別轉化進入表達感受態細胞Transetta2；

（2）融合蛋白原核表達及可溶性分析：以陽性重組質粒轉化步驟（1）所得大腸桿菌Transetta2感受態細胞，挑取單菌落接種至5mL含100μg/mL 氨芐的 LB培養基中，37℃，200r/min震蕩培養，當菌液濃度OD₆₀₀值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.25mM，22℃，200r/min震蕩誘導過夜；用不加IPTG誘導的菌液做對照，離心收集沉淀，用PBS重懸沉淀，于超聲波細胞破碎儀上破碎4-6min，11000-13000r/min離心4-6min，分別取出上清、沉淀，加入SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液，95℃加熱10min，用12% SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白是否為可溶性蛋白；

（3）重組融合蛋白的誘導表達及純化：

d、誘導表達：將步驟（2）鑒定所得能可溶性表達的菌落接種于500mL含LB培養基中進行誘導表達；4400-4600r/min離心14-16min收集菌體，用pH為7.6含有50mM的磷酸鹽，150mM的NaCl， 5mM的咪唑的Binding Buffer緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎18-22min，超聲參數為：功率20%，超聲1s，間停3s；再11000-13000r/min離心28-32min，4℃收集上清，棄菌體沉淀；

e、初步純化：將步驟d所得上清加入鎳親和層析柱中，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，蛋白得到初步純化，取樣液加入SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液，95℃加熱10 min，用12% SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達情況；

f、進一步純化：將步驟e所得樣品用10kDa的超濾管離心濃縮4℃，4000 r/min，10min/次，再用Superdex ^TM200進一步純化，然后再次用SDS-PAGE檢測純化的產物并離心濃縮；用考馬斯亮藍染色的方法測定蛋白濃度，并至于-80℃保存；

（4）磷脂酰膽堿脂質體的制備：稱取10mg磷脂酰膽堿，用2mL甲醇溶解，加0.5mL含有25mM HEPES，100mM NaCl，pH7.4的HBS緩沖液，在旋轉蒸發儀中去除甲醇后加入2mL HBS，在超聲波浴中乳化10min，并用HBS定溶到10mL，再-80℃反復凍融3次得到1mg/mL的脂質體；

（5）表面等離子共振技術檢測鴨Hsp90α及各片段與磷脂酰膽堿的相互作用：

g、生物傳感芯片L1的準備：將L1芯片安裝到Biacore X100 Plus系統中，所有用到的溶液都經過0.22μm濾膜過濾；用50 mM NaOH：異丙醇體積比2:3,的混合溶液清洗3次，每次1min，流速設定為10μL·min^-1；再用pH7.4的HBS緩沖液清洗系統及芯片，流速設定為10μL·min^-1；

h、待基線平穩后，進行以下步驟：注入30μL 配好的脂質體，使脂質體偶聯的L1芯片上，流速1μL·min^-1；注入50mM NaOH洗掉未偶聯的脂質體1min，流速10μL·min^-1；用0.1mg/mL BSA檢查芯片的親脂基團是否飽和，如果沒有BSA結合，證明L1芯片已經被脂質體飽和，用HBS緩沖液平衡芯片到基線平穩；稀釋至少5個濃度的蛋白，注入到芯片上，流速30μL·min^-1；每次上完樣，用合適濃度的NaOH再生芯片。

2.如權利要求1所述確定鴨Hsp90α蛋白結合磷脂酰膽堿區域的方法，其特征是：步驟（1）b所述特異性引物如下：

上游引物F：5'-CTCGGATCCATGCCTGAGGCTG T-3'，下劃線是BamH1酶切位點；

下游引物R：5'-TACGTCGACATCCACCTCCTCCAT-3'，下劃線是Sal1酶切位點；

N-F：5'-TTGGGATCCATGCCTGAGGCTGT-3'；

N-R：5'-GACGTCGACGAGCCTGATAGGAT-3'；

M-F：5'-CAGGGATCCATGGAGAAGTACATCG-3'；

M-R：5'-GACGTCGACAGAAACCAGGGTCT-3'；

C-F：5'-CCGGGATCCATGGAAGAAGAGAAAAAG-3'；

C-R：5'-TACGTCGACATCCACCTCCTCCAT-3'。