[發(fā)明專利]一種侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710120098.8
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106908611A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋傳寶
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽威爾試劑盒科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: G01N33/96
• 分類號: G01N33/96;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 安徽合肥華信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司34112
• 代理人: 方琦

技術(shù)領(lǐng)域

一種制備侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清的制備方法，屬免疫技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

黃瓜花病毒(CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucurnovirus)的典型成員，具有典型的三分體正義單鏈RNA (ssRNA)病毒的特點(diǎn)。CMV的寄主范圍十分廣泛，它能侵染包括茄科、十字花科、豆科等1000多種植物，對經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)生嚴(yán)重危害。CMV侵染生姜后出現(xiàn)花葉、矮化或者褪綠，且這些癥狀往往是復(fù)合出現(xiàn)。CMV因其發(fā)生的普遍性和所引起病害的嚴(yán)重性，是目前研究最多的植物RNA病毒之一。

生姜(Zingiber offcinale Rosc．)為姜科姜屬多年生宿根草本植物，侵染生姜并引起嚴(yán)重危害的病毒主要是黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 和煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)。由于生姜采用無性繁殖，病毒逐年積累，病毒危害也逐年加重，病毒病可導(dǎo)致生姜減產(chǎn)30-50%，且影響品質(zhì)。目前沒有防治病毒病的有效藥物，解決病毒病的途徑是通過篩選無病毒生姜進(jìn)行繁育，建立種子基地，用無病毒良種栽培。

雖然檢測植物病毒的方法有多種，但間接ELISA法是最常用的方法，每次可以檢測幾十乃至上百個(gè)樣品，是一種經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法，成本也低。由于市場上沒有能檢測侵染生姜的黃瓜花葉病毒的抗血清，脫毒生姜種苗的質(zhì)量多通過目測或者指示植物方法確定是否脫毒完全，既缺乏科學(xué)性又費(fèi)時(shí)。本發(fā)明制備檢測侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清，可大大方便該病毒的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明用感染黃瓜花葉病毒的生姜葉片為材料，首先粗提取病毒顆粒，然后通過5-20%梯度SDS-PAGE分離其外殼蛋白，切下乳白色外殼蛋白（CP）條帶，將含CP的凝膠磨細(xì)后免疫注射小鼠，獲得高效價(jià)的抗黃瓜花葉病毒血清。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種制備侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、粗病毒的提取將黃瓜花葉病毒侵染的生姜病葉勻漿，過濾和低速離心去除大的固體雜質(zhì)，四氯化碳去除葉綠素，加入聚乙二醇6000（PEG6000）、NaCl和Triton-X 100后靜置使病毒粒子沉淀，用20%蔗糖墊進(jìn)一步純化獲得的黃瓜花葉病毒顆粒， 將其溶解于PBS中，得到病毒懸液，于-80°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

b、黃瓜花葉病毒外殼蛋白的5-20% SDS-PAGE梯度分離純化將病毒懸液與等體積的1.5-2.5倍SDS上樣緩沖液混合，沸水浴加熱8-12分鐘，冷卻后離心除去沉淀，然后將樣品加入制備型的5-20% SDS-PAGE梯度凝膠板中電泳，完畢后凝膠用4°C的0.25M KCl浸泡染色，切下乳白色的黃瓜花葉病毒外殼蛋白條帶，平分3-5份；

c、將含外殼蛋白的凝膠加生理鹽水磨細(xì)后，免疫注射3-5只小鼠，4次免疫注射，兩次之間間隔6-7天，第一次注射方式為皮下注射0.24-0.26 mL,腹腔注射0.24-0.26 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射0.48-0.52 mL，第四次注射后第3天斷頭取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清。

所述的抗血清制備方法制得的抗血清。

所述的抗血清在侵染生姜黃瓜花葉病毒檢測上的應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)效果體現(xiàn)在幾個(gè)方面：

1、制備的抗血清特異性強(qiáng)

由于采用梯度制備電泳的方法純化黃瓜花葉病毒的外殼蛋白（CP），純化的CP特別純，不含其他蛋白，因此制備的抗血清只與黃瓜花病毒CP作用，特異性很強(qiáng)；

2、不使用昂貴的福氏佐劑，降低抗血清的生產(chǎn)成本

本發(fā)明將外殼蛋白（CP）包埋在網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，外殼蛋白（CP）從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動(dòng)物體內(nèi)，抗原在動(dòng)物體內(nèi)停留時(shí)間長，充分刺激免疫系統(tǒng)，用聚丙烯酰胺凝膠替代了昂貴的福氏佐劑。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：

第一步：粗病毒的提取

（1）取100 g黃瓜花葉病毒侵染的生姜病葉勻漿，加入400 mL的Buffer A (0.5 mol/L 磷酸鉀緩沖液，含0.1 % 2-巰基乙醇，0.01 mol/L EDTA，pH 7.0)，用4層紗布過濾，經(jīng)低速離心（5,000 g）15 分鐘去除固體雜質(zhì)；

（2）將上清液加1/4體積的四氯化碳（CCl₄）劇烈攪拌5 分鐘，低速離心（5,000 g）20 分鐘去除沉淀的葉綠素；