[發(fā)明專利]抗CEA抗原VHH結(jié)構(gòu)域及含有其的雙特異性抗體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710120052.6
• 申請(qǐng)日: 2017-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN106946989B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋海鵬;于建立;劉原源;李飛;王歡;黃琪;古一;周宇航;李婧嬋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市國(guó)創(chuàng)納米抗體技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/30
• 分類號(hào): C07K16/30;C07K16/46;C12N15/13;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 北京市眾天律師事務(wù)所 11478
• 代理人: 李新軍

本發(fā)明公開了一種抗CEA抗原的VHH結(jié)構(gòu)域及單域抗體，以及含有兩種VHH結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體，所述抗體由兩條不同的重鏈序列融合而成，可以分別識(shí)別CEA抗原的不同表位。所述VHH結(jié)構(gòu)域、單域抗體以及雙特異性抗體均具有優(yōu)異的抗體識(shí)別能力，顯著的ADCC效應(yīng)、并具有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，在體內(nèi)外診斷和藥物制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種多肽，更具體地，公開了一種抗體，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

癌胚抗原(CEA，又稱為CEACAM-5或CD66e)是一種具有約180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成員，并且含有經(jīng)由糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨與細(xì)胞膜連接的7個(gè)域。7個(gè)域包括單一N端Ig可變域和與Ig恒定域同源的6個(gè)域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分類為僅在胎兒組織中表達(dá)的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在已經(jīng)在幾種正常成年組織中鑒定出。CEA的過(guò)量表達(dá)在許多類型的癌癥中觀察到，包括結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌和甲狀腺癌。因此，CEA已經(jīng)被鑒定為腫瘤相關(guān)抗原。CEA容易自細(xì)胞表面切割，并直接或經(jīng)由淋巴系統(tǒng)自腫瘤脫落入血流中。由于此特性，已經(jīng)使用血清CEA的水平作為臨床標(biāo)志物以診斷癌癥并篩選癌癥。而且，CEA也已被用作腫瘤標(biāo)記，測(cè)量癌癥患者血液中升高的CEA的免疫學(xué)測(cè)定法已在臨床上用于癌癥的預(yù)后和控制。

更重要的是，CEA已成為用于靶向治療的潛在有用的腫瘤相關(guān)抗原。已經(jīng)報(bào)道的使用CEA靶向免疫治療癌癥主要有2種主要方法：一種方法使用抗CEA抗體引發(fā)免疫細(xì)胞的溶解活性，特別是通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，以消除表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞。另一種方法是通過(guò)抗CEA抗體或抗體片段與例如藥物、毒素、放射性核苷酸、免疫調(diào)節(jié)劑或細(xì)胞因子等效應(yīng)分子綴合，特異性靶向表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮效應(yīng)分子的治療作用。

目前已經(jīng)針對(duì)CEA生成多種單克隆抗體。Chester等已經(jīng)自噬菌體展示文庫(kù)分離出單鏈抗CEA抗體以在放射性免疫檢測(cè)和放射性免疫療法中使用(美國(guó)專利No.5,876,691)，隨后將抗體人源化(美國(guó)專利No.7,232,888)。放射性標(biāo)記的抗CEA抗體已經(jīng)在結(jié)腸直腸癌患者的臨床試驗(yàn)中使用。

1993年，Hamers-Casterman等研究發(fā)現(xiàn)，在駱駝科動(dòng)物(駱駝，單峰駱駝和美洲駝)的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種天然缺失輕鏈的抗體，即，僅有重鏈的抗體(heavychain-only-likeAntibody，HCAbs)，由于該抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(VHH)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，其抗原結(jié)合區(qū)僅是一個(gè)通過(guò)鉸鏈區(qū)與Fc區(qū)連接的單結(jié)構(gòu)域，因此該類抗體又稱為單域抗體。該類抗體不像人工改造的單鏈抗體片段(scFv)那樣容易相互沾粘，甚至聚集成塊。VHH結(jié)構(gòu)域的晶體為2.5nm，長(zhǎng)4nm，分子量只有15KDa，此也被稱作納米抗體(Nanobody，Nb)，單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)的VHH結(jié)構(gòu)具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合活性，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位。

相對(duì)于常規(guī)的四鏈抗體的scFv而言，納米抗體或者單域抗體在親和力方面與其對(duì)應(yīng)的scFv相當(dāng)，但在可溶性、穩(wěn)定性、對(duì)聚集的抗性、可重折疊性、表達(dá)產(chǎn)率以及DNA操作、文庫(kù)構(gòu)建和3-D結(jié)構(gòu)測(cè)定的容易性方面超越scFv。因此，納米抗體或單域抗體在疾病的治療和診斷中具有很大的價(jià)值，在腫瘤的抗體靶向診斷和治療中也具有很大的發(fā)展前景。但是，基于單表位識(shí)別抗體存在的結(jié)構(gòu)性缺陷也同時(shí)制約著該類抗體的進(jìn)一步應(yīng)用。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的天然抗體雖然是雙價(jià)抗體，但是兩組相同的重鏈和輕鏈組合，只能識(shí)別和結(jié)合相同的抗原表位，這種單價(jià)的線性結(jié)合不僅會(huì)使識(shí)別和結(jié)合的能力低下，還會(huì)因?yàn)榻Y(jié)合表位的缺失和變異而難以完成識(shí)別和結(jié)合的目的。

雙特異性抗體是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種抗體技術(shù)，可以同時(shí)識(shí)別2種不同的抗原。利用雙特異性抗體，可以研發(fā)同時(shí)針對(duì)同一抗原不同表位的雙價(jià)抗體。