[發明專利]耐除草劑大豆SHZD32?1及其衍生品種的實時熒光定性PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201710119878.0
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106636445A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 徐俊鋒;汪小福;陳笑蕓;魏巍;徐曉麗;彭城
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙)11598
• 代理人: 余光軍,霍雪梅

技術領域

本發明涉及耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的定性PCR檢測方法，尤其涉及耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實時熒光定性PCR檢測方法，屬于耐除草劑大豆的定性檢測領域。

背景技術

隨著基因工程技術的飛速發展，轉基因作物種植面積和轉基因作物品種都大量增加，同時轉基因植物及其產品安全性也引起全球范圍內的關注和擔憂。為了有效監管轉基因植物及其產品，保障消費者的合法權益，目前，包括中國在內的全世界50多個國家頒布并實施了轉基因生物安全標識制度和配套的管理規定。中國的基因工程育種技術發展迅速，近年來育成了一系列的轉基因品種作物，因此制定相關的轉基因生物安全評價方法顯得尤其重要。

在轉基因作物及其產品安全檢測方法中，PCR技術以其靈敏度高、穩定性好、準確性強、操作簡便成為國際上轉基因植物及其產品檢測的主要方法，中國近年來頒布的轉基因生物及其產品安全評價方法也是以PCR檢測方法為主。根據檢測目的基因的不同，PCR檢測方法分為篩查、基因特異性、構建特異性和轉化體特異性檢測；其中，轉化體特異性檢測方法的特異性最高，篩查檢測和轉化體特異性檢測方法是實際檢測中應用最廣泛的方法。篩查檢測方法主要用于初步檢測樣品中是否含有轉基因成分，轉化體特異性檢測方法可以準確確定轉基因植物的身份。

轉基因耐草甘膦大豆SHZD32-1由上海交通大學研發，利用農桿菌介導法將密碼子經優化的耐草甘膦基因G10-EPSPS導入了栽培大豆品種“中豆32”獲得轉G10-EPSPS基因的耐草甘膦大豆SHZD32-1。G10是一個新的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。溫室試驗和中間試驗表明，轉G10基因耐草甘膦大豆的耐草甘膦性能良好，能夠達到耐除草劑的運用水平，已經獲批進行環境試驗。到目前為止，中國尚未發布專門針對耐草甘膦大豆SHZD32-1及其衍生品種檢測的方法。因此，迫切需要盡快制定相關檢測方法，為中國轉基因生物安全管理部門實施各項安全管理制度提供科學方法和技術支撐。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供用于檢測耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實時熒光定性PCR檢測引物對和探針；

本發明所要解決的第二個技術問題是建立一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實時熒光定性PCR檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

本發明根據耐除草劑大豆SHZD32-1的兩端側翼序列，分別在兩端設計了引物和探針。本發明所設計的實時熒光定性PCR檢測引物對和探針的核苷酸序列如下：

右側的引物為由核苷酸序列為SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物組成的引物對1；所述探針為核苷酸序列為SEQ ID No.3所示的探針1；

左側的引物為由核苷酸序列為SEQ ID No.4所示的正向引物和SEQ ID No.5所示的反向引物組成的引物對2；所述探針為核苷酸序列為SEQ ID No.6所示的探針2。

本發明進一步分別利用這兩端的引物和探針擴增SHZD32-1大豆基因組DNA，對兩側設計得到的引物做標準曲線驗證引物工作效率，篩選最佳的引物和探針組合。擴增結果證明，右側的引物與探針明顯優于左側的引物和探針。本發明將右側的引物與探針分別命名為SHZD32-1QF(SEQ ID No.1所示)、SHZD32-1QR(SEQ ID No.2所示)、SHZD32-1P(SEQ ID No.3所示)。

本發明所述的實時熒光定性PCR檢測引物對和探針能夠應用于檢測耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種。

本發明進一步公開了一種耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種的實時熒光定性PCR檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待檢測大豆樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，以本發明所述的實時熒光定性PCR檢測引物對和探針建立PCR擴增體系并進行實時熒光PCR擴增；(3)如果發生特異性擴增(即從待檢測樣品中擴增獲得典型的擴增曲線)，則待檢測的大豆樣品是耐除草劑大豆SHZD32-1或其衍生品種；如果未發生特異性擴增(即從待檢測樣品中未能擴增出典型的擴增曲線)，則待檢測的大豆樣品不是耐除草劑大豆SHZD32-1或其衍生品種。