[發(fā)明專利]一種山豆根中黃酮類化合物的提取檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710119804.7
• 申請(qǐng)日: 2017-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN106770839B
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李行諾;鄭麗瓊;顏繼忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06;G01N30/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種山豆根中黃酮類化合物的提取檢測(cè)方法，待檢測(cè)的黃酮類化合物為lupinifolin和山豆根色滿二氫黃酮C，分別簡(jiǎn)稱為黃酮1和黃酮4，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：

(a)制備黃酮類化合物提取液

將山豆根藥材粉末和吸附劑混合并研磨均勻，得到固體混合物；將所得固體混合物裝填入固相萃取柱中，并用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，離心取上層清液，得到黃酮類化合物提取液；

所述山豆根藥材粉末和吸附劑的質(zhì)量比為1：0.5～3；

所述的吸附劑為：C₁₈、Al₂O₃、硅膠、硅藻土、弗羅里硅土、ZSM-5、TS-1、SAPO-11、MCM-48或SBA-15；

所述研磨的時(shí)間為90～210s；

所述的洗脫劑為：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲醇/乙腈體積比1：1的混合溶劑或甲醇/乙醇體積比1：1的混合溶劑；

所述洗脫劑的體積用量為固相萃取柱體積的0.15～0.8倍；

(b)檢測(cè)樣品溶液

取步驟(a)中制備的黃酮類化合物提取液，揮干后先用甲醇溶解配制成50～100mg/mL濃度的溶液，再用0.25mM硼砂緩沖液稀釋1～5倍，然后經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液即為待測(cè)樣品溶液；采用反向微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法對(duì)所得待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)樣品溶液的電泳譜圖；

所述微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法的分離條件為：色譜柱為56cm×50μm未涂層石英毛細(xì)管，運(yùn)行電壓-15～-30v；檢測(cè)溫度20～35℃；常規(guī)電壓進(jìn)樣條件：-20kv，5s；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；微乳液組成：表面活性劑0.8％～3.0％、輔助表面活性劑2.2％～10％、油相0.3％～0.9％、有機(jī)改性劑10％～20％、手性拆分劑10mM、余量為緩沖液pH＝1～3的10～30mM NaH₂PO₄水溶液；

所述微乳液的組成中，所述的表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，所述的輔助表面活性劑為正丁醇，所述的油相為乙酸乙酯，所述的有機(jī)改性劑為乙腈，所述的手性拆分劑為甲基-β-環(huán)糊精或磺丁基-β-環(huán)糊精鈉；

所述反向微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法的富集條件為：樣品基質(zhì)pH＝7.5～9.5的0.1～10mmol/L硼砂緩沖液，水塞組成體積分?jǐn)?shù)10％乙腈水溶液，進(jìn)水時(shí)間5～40s，進(jìn)樣時(shí)間20～40s，進(jìn)樣電壓-10～-25kv，運(yùn)行電壓-20kv，檢測(cè)溫度25℃；

(c)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取黃酮1和黃酮4標(biāo)準(zhǔn)品，配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用反向微乳毛細(xì)管電動(dòng)色譜法并按照步驟(b)中的分離條件和富集條件分別對(duì)各混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的電泳譜圖，分別以譜圖中黃酮1和黃酮4的峰面積為縱坐標(biāo)，以混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中黃酮1和黃酮4的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，獲得黃酮1和黃酮4的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

所述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法為：精密稱取質(zhì)量比為1：1～3的黃酮1和黃酮4標(biāo)準(zhǔn)品，先用甲醇溶解制備黃酮1濃度在0.5～1200μg/mL范圍內(nèi)的溶液，再用0.25mM硼砂緩沖液稀釋1.2～1200倍；

(d)獲取樣品檢測(cè)結(jié)果

將步驟(b)所得待測(cè)樣品溶液的電泳譜圖中黃酮1和黃酮4的峰面積值代入步驟(c)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得出待測(cè)樣品溶液中黃酮1和黃酮4的質(zhì)量濃度，進(jìn)而換算得到山豆根中黃酮1和黃酮4的含量。

2.如權(quán)利要求1所述的山豆根中黃酮類化合物的提取檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a)中，所述山豆根藥材粉末和吸附劑的質(zhì)量比為1：1～3。

3.如權(quán)利要求1所述的山豆根中黃酮類化合物的提取檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a)中，所述的吸附劑為：SBA-15。

4.如權(quán)利要求1所述的山豆根中黃酮類化合物的提取檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a)中，所述研磨的時(shí)間為120～180s。

5.如權(quán)利要求1所述的山豆根中黃酮類化合物的提取檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a)中，所述的洗脫劑為：甲醇。