[發明專利]一株酶活和溫度穩定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201710119423.9
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106591271B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: 張濤;江波;蔣航宇;沐萬孟;繆銘
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/10;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種酶活和溫度穩定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體，其氨基酸序列為SEQ IDNo.1。

2.權利要求1所述的酶活和溫度穩定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體的基因DNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一種重組質粒，其特征在于包含了權利要求2所述的DNA分子。

4.一種宿主細胞，其特征在于其含有如權利要求2所述的DNA分子，或含有如權利要求3所述的重組質粒。

5.根據權利要求1所述的酶活和溫度穩定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，將含有精氨酸脫亞胺酶突變體基因序列DNA的重組質粒轉入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)宿主中，構建突變體，進行序列驗證確認，得到一株酶活和溫度穩定性提高的突變體Gly292Pro。

6.權利要求1所述的酶活和溫度穩定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）根據Enterococcus faecalis SK32.001的精氨酸脫亞胺酶arcA基因序列設計引物，以含有精氨酸脫亞胺酶序列的Enterococcus faecalis SK32.001為模板，通過PCR的方法獲得含有精氨酸脫亞胺酶arcA的基因片段，與表達載體pET-28a連接構建重組質粒；

2）利用B-FITTER軟件識別出酶分子中對溫度穩定性有不利影響的關鍵氨基酸殘基，然后利用SWISS-MODEL軟件對親本精氨酸脫亞胺酶進行蛋白結構模擬，獲得精氨酸脫亞胺酶三級結構；通過分析對比，確定要突變的氨基酸位點為第292位甘氨酸；

3）設計突變引物，使用一步PCR法對精氨酸脫亞胺酶的核苷酸序列進行定點突變，將所述第292位的氨基酸進行替換，獲得含精氨酸脫亞胺酶突變體基因序列的重組載體；

4）將含有精氨酸脫亞胺酶突變體基因序列的重組載體通過熱激轉化進入大腸桿菌E. coli BL21(DE3)感受態細胞中，并誘導表達，收集菌體，超聲破碎細胞后使用Ni-NTA進行蛋白分離純化，獲得精氨酸脫亞胺酶突變體。

7.權利要求1所述的酶活和溫度穩定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體的應用，其特征在于，所述的精氨酸脫亞胺酶突變體用于瓜氨酸的生產。