[發(fā)明專利]一株酶活和溫度穩(wěn)定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710119423.9
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106591271B
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張濤;江波;蔣航宇;沐萬孟;繆銘
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/10;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種酶活和溫度穩(wěn)定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。該精氨酸脫亞胺酶突變體為酶活性中心附近的甘氨酸突變?yōu)楦彼?，即Gly292 Pro。本發(fā)明利用定點突變技術(shù)對野生型精氨酸脫亞胺酶arcA編碼基因進(jìn)行分子改造，得到了一種突變體酶ADI^G292P，相對于野生型精氨酸脫亞胺酶氨基酸序列的第292位甘氨酸突變?yōu)楦彼?。本發(fā)明所述的定點突變改造的精氨酸脫亞胺酶與野生酶相比其酶活力提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍，解決了精氨酸脫亞胺酶催化瓜氨酸合成時，催化能力和溫度穩(wěn)定性低的問題，為高效合成瓜氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)及醫(yī)藥應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶活和溫度穩(wěn)定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，EC 3.5.3.6）簡稱ADI，它能將精氨酸水解，生成瓜氨酸和氨。自從1933年首次報道以來，已在乳鏈球菌、糞鏈球菌、酵母、假單胞菌、支原體、鹽桿菌及部分真核細(xì)胞等中發(fā)現(xiàn)有該酶存在。精氨酸脫亞胺酶來源廣泛，目前在細(xì)菌、古細(xì)菌及一些真核細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)。不同微生物來源的ADI分子量范圍、最適pH、最適溫度等性質(zhì)均有明顯的差異。但這些ADI均有分解精氨酸的能力。

瓜氨酸(Citrulline)又名氨基甲酰鳥氨酸(Carbamylornithine ornithin)，由于最初是從西瓜中提取，因而得名。近年來，研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸具有清除自由基、影響人體內(nèi)氮平衡、心血管系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)等生理功能。因此，瓜氨酸在食品醫(yī)藥等方面的應(yīng)用日益增加。由于瓜氨酸的抗衰老、增強免疫力、提高運動員肌肉力量和耐力等功能，已有加拿大公司生產(chǎn)的運動功能性飲料中添加瓜氨酸。同時，在歐美國家也有含有瓜氨酸的保健護(hù)膚品上市銷售。

生產(chǎn)瓜氨酸主要有化學(xué)法、提取法、發(fā)酵法和酶法四種生產(chǎn)方式。其中，化學(xué)法是目前主要的生產(chǎn)方式，但其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的銅離子和硫化氫等副產(chǎn)物產(chǎn)生對環(huán)境造成不利影響。提取法和發(fā)酵法生產(chǎn)瓜氨酸均有產(chǎn)率低和成本高的問題，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。而使用酶法生產(chǎn)瓜氨酸具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、提取工藝簡單等優(yōu)點，具有較高的研究和生產(chǎn)價值。因此，尋找催化效率更高、安全穩(wěn)定的精氨酸脫亞胺酶成為酶法生產(chǎn)瓜氨酸的關(guān)鍵問題。

定點突變（sit-directed mutagenesis）是一種分子改造的主要手段，是指在目的DNA片段的指定位點引入特定的堿基對，從而改變其編碼的氨基酸序列的技術(shù)。與其他改善分子改造的策略相比，定點突變更為迅速、直接和節(jié)約成本，因此它是實驗室常用的基因改造的手段之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，通過對精氨酸脫亞胺酶的分子改造，使改造后的精氨酸脫亞胺酶的酶活和溫度穩(wěn)定性有所提高，最終應(yīng)用于瓜氨酸的生產(chǎn)及醫(yī)藥。

本發(fā)明提供了一種定點突變改造的精氨酸脫亞胺酶突變體，由糞腸球菌Enterococcus faecalis SK32.001的精氨酸脫亞胺酶基因出發(fā)，運用定點突變技術(shù)獲得，所述的精氨酸脫亞胺酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID No.1，該精氨酸脫亞胺酶突變體是由SEQ ID No.2的核苷酸系列所編碼。

所述的氨基酸發(fā)生突變位于精氨酸脫亞胺酶蛋白結(jié)構(gòu)的外部，所述的突變可能可以增加蛋白疏水相互作用或靜電相互作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種酶活和溫度穩(wěn)定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID No.1。

所述的酶活和溫度穩(wěn)定性提高的精氨酸脫亞胺酶突變體的基因DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種重組質(zhì)粒，包含了所述的DNA分子。

一種宿主細(xì)胞，其含有如所述的DNA分子，或含有如所述的重組質(zhì)粒。