[發(fā)明專利]一種從胸水中提取cfDNA的方法、試劑盒以及構建的cfDNA文庫

有效

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• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106867996B
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設計）人: 邵陽;汪笑男;吳雪;王富鋒;包華
• 申請（專利權）人: 南京世和基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B40/06;C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權代理有限公司 32243
• 代理人: 鄧唯

本發(fā)明涉及一種從胸水樣本中提取cfDNA，用于構建高通量測序文庫的方法，屬于基因檢測技術領域。本發(fā)明首次成功地從胸水中提取到了cfDNA，經(jīng)驗證可作為高通量測序文庫構建的樣本來源，并且可以成為血漿cfDNA的一種有效補充；此外，該方法中通過對胸水樣本中cfDNA大小片段分離后，使得胸水樣本中的cfDNA純度更高，使其更適合于DNA文庫的構建，更利于后期突變的檢出，可以解決常規(guī)僅通過血漿提取cfDNA建庫的樣本單一性和檢出率問題。

技術領域

本發(fā)明涉及一種從胸水中提取cfDNA的方法、試劑盒以及構建的cfDNA文庫，屬于基因檢測技術領域。

背景技術

隨著發(fā)病率和死亡率的不斷增加，癌癥已經(jīng)成為中國人群死亡的首要原因和主要的公共健康問題。根據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計，2015年中國約有429萬例癌癥新發(fā)病例，281萬例癌癥患者死亡，肺癌成為最常見的癌癥，也是癌癥死亡的首要原因。伴隨著各種治療手段的不斷興起，如早期的放療，近代的化療到現(xiàn)在的靶向治療及免疫治療，癌癥的治療正逐漸向精準化治療模式發(fā)展，特別是靶向治療和免疫治療，由此對于特異性靶向人群的篩選顯得尤為重要，而作為靶向藥物療法中不可或缺的臨床輔助手段，癌癥的基因檢測直接關系到藥物對于患者的治療效率。

高通量測序技術又稱為下一代測序技術，由于其高通量，靈敏度高等特性，在癌癥基因檢測中得到廣泛應用。作為高通量測序最為重要的一環(huán)，文庫樣本的制備顯得尤為重要，目前用的比較普遍的檢測樣本有患者的腫瘤組織樣本，穿刺樣本等，但是這些無疑都是屬于侵入性的。而隨著技術的進步，血漿樣本也被逐漸應用到高通量測序中，血漿游離DNA（cell free DNA，cf-DNA），是血漿中游離存在的DNA，cfDNA來源于機體細胞損傷，有的來自于正常細胞，有的來自于異常細胞（如腫瘤細胞）。對于健康人，其血液中的cfDNA主要來源是體細胞正常的新陳代謝，因此應該維持在一個較低的水平。然而，當有異常細胞（腫瘤細胞）形成或者有很嚴重的系統(tǒng)性器官損傷時，大量死亡的細胞（不管是凋亡或是壞死）會產(chǎn)生大量的cfDNA。并且其無創(chuàng)特性受到廣泛推崇，高通量測序結合血漿ctDNA液態(tài)活檢可以實現(xiàn)對腫瘤患者的動態(tài)檢測。但是血漿樣本突變的檢出，受多種因素的影響，腫瘤所處的狀態(tài)如患者目前疾病穩(wěn)定還是進展會影響腫瘤特有突變的檢出，諸如此類癌癥分期，癌癥轉(zhuǎn)移的部位等都可能影響到血漿中ctDNA的檢出，因此迫切的需要一種液態(tài)活檢樣本的補充。

胸水主要在晚期肺癌中最為常見，其它腫瘤如乳腺癌、淋巴瘤等都可能轉(zhuǎn)移到胸腹腔而引起癌性胸水，在肺癌中惡性胸水的發(fā)生率高達60%，發(fā)病原因主要是胸膜轉(zhuǎn)移結節(jié)侵犯和阻塞毛細血管和淋巴管所致。

發(fā)明內(nèi)容

通過大量試驗探索，本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)了一種能夠從胸水中提取得到較高純度的cfDNA的方法和專用試劑盒，利用該技術可以優(yōu)化現(xiàn)有技術中從血漿中提取cfDNA檢出率不足的問題；并且通過對樣本進行處理之后，能夠有效地實現(xiàn)DNA文庫的構建，這種方法提取得到的cfDNA可以通過高通量測序，能夠有效檢出患者攜帶的突變，并且發(fā)現(xiàn)采用這種方法得到的cfDNA構建文庫測序之后，在一些樣本中其突變的檢出率要高于血液/血漿樣本中的cfDNA，從而更能有效提示患者預后，用藥等信息。

本發(fā)明的第一個方面：

提供了一種從胸水中提取cfDNA的方法，包括如下步驟：

第1步，對胸水樣本進行離心分離；

第2步，在第1步得到的上清中加入Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液，進行孵育處理，再加入DNA析出液；

第3步，將第2步得到的樣品采用柱吸附的方式對cfDNA進行吸附，再經(jīng)過解吸之后，獲取到cfDNA。

在一個實施例中，所述的裂解液中包含有50～150 mmol Tris-HCl、20～30 mmolEDTA、400～600 mmol NaCl、0.5～1.5% SDS。