[發(fā)明專利]一種從胸水中提取cfDNA的方法、試劑盒以及構建的cfDNA文庫

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710117869.8
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106867996B
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設計）人: 邵陽;汪笑男;吳雪;王富鋒;包華
• 申請（專利權）人: 南京世和基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B40/06;C40B50/06;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權代理有限公司 32243
• 代理人: 鄧唯

1.一種從胸水中提取cfDNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

第1步，對胸水樣本進行離心分離；

第2步，在第1步得到的上清中加入Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液，進行孵育處理，再加入DNA析出液；

第3步，將第2步得到的樣品采用柱吸附的方式對cfDNA進行吸附，再經(jīng)過解吸之后，獲取到cfDNA；

所述的裂解液中包含有100 mmol Tris-HCl、25 mmol EDTA、500 mmol NaCl、1% SDS；

所述的DNA析出液中包含有0.15 mol/L NaCl、0.02～0.05 M 磷酸鹽溶液；

柱吸附中采用的是硅膠膜吸附柱；

在進行解吸之前，依次采用鹽洗滌溶液和醇洗滌溶液對吸附柱進行沖洗；

所述的鹽洗滌溶液中包括有：10～20 mM 三羥甲基氨基甲烷；1～5 M 鹽酸胍、10～30mM EDTA-2Na、0.1～1% HCl；

所述的醇洗滌溶液是由75～80vol.%的乙醇和異丙醇1:1配制；

所述的Carrier RNA的加入量是是每毫升胸水樣本中加入5～50μl，蛋白酶K的加入量是每毫升胸水樣本中加入50～500μl，裂解液的加入量是每毫升胸水樣本中加入0.5～5ml，DNA析出液的加入量是每毫升胸水樣本中加入0.5～5ml；

鹽洗滌溶液的用量是每毫升胸水樣本對應30～100μl；

醇洗滌溶液的用量是每毫升胸水樣本對應150～300μl；

解吸所采用的解吸液是無酶水；

2.一種從胸水中提取cfDNA的試劑盒，其特征在于，包括有：裂解液、DNA析出液、蛋白酶K、Carrier RNA、吸附柱、鹽洗滌溶液、醇洗滌溶液、解吸液；裂解液、DNA析出液、蛋白酶K、Carrier RNA、鹽洗滌溶液、醇洗滌溶液的體積比范圍是：500～5000：500～5000：50～500：5～50：30～100：150～300；所述的解析液是無酶水；

所述的裂解液中包含有100 mmol Tris-HCl、25 mmol EDTA、500 mmol NaCl、1% SDS；

所述的DNA析出液中包含有0.15 mol/L NaCl、0.02～0.05 M 磷酸鹽溶液；

柱吸附中采用的是硅膠膜吸附柱；

所述的鹽洗滌溶液中包括有：10～20 mM 三羥甲基氨基甲烷；1～5 M 鹽酸胍、10～30mM EDTA-2Na、0.1～1% HCl；

所述的醇洗滌溶液是由75～80vol.%的乙醇和異丙醇1:1配制。

3.一種cfDNA文庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

第1步，對權利要求1所述的從胸水中提取cfDNA的方法得到的cfDNA進行大小片段分離；

第2步，對小片斷cfDNA依次進行末端修復、3'末端加上堿基A、兩端加上接頭、純化，得到cfDNA文庫；所述的第1步中的大小片段分離是采用磁珠法分離。

4.cfDNA文庫在基因測序中的應用；所述的cfDNA文庫是指通過權利要求3所述的cfDNA文庫的構建方法得到的；所述的基因測序是采用NGS方法；所述的基因是EGFR基因或者ALK基因；所述的應用，是指NGS基因突變敏感性檢測。