[發(fā)明專利]一種嗜酸乳桿菌凍干粉的制備方法

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• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106701642A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余萍;張春宇;閔祥博
• 申請（專利權(quán)）人: 漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;A23L33/135;C12R1/23
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司21207
• 代理人: 胡洋

1.一種嗜酸乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)菌種劃線培養(yǎng)：嗜酸乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后，于MC培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，劃線結(jié)束后，平皿倒置，35℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)40～72小時；

2)一級純化培養(yǎng)：挑取平皿上溶鈣圈較大的單菌落接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，試管密封，35℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)30～50小時；

3)二級純化培養(yǎng)：按3～5％接種量，將培養(yǎng)好的一級菌懸液接種至裝有MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)基裝液體積占三角瓶容積的40％～60％，三角瓶密封，35℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)30～50小時；

4)菌種保存：將二級純化培養(yǎng)得到的菌懸液進(jìn)行離心，12000rpm離心10分鐘后得到菌泥，將菌泥溶解于MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液的混合溶液中，得菌泥混合液，再將菌泥混合液分裝在已滅菌的凍存管中，得嗜酸乳桿菌菌泥凍存管，封口膜密封，凍存于-40～-80℃低溫冰箱內(nèi)，備用；

5)凍存菌種復(fù)蘇：取存于低溫冰箱內(nèi)嗜酸乳桿菌菌泥凍存管，立即放入35℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇，30～45s，至凍存管內(nèi)液體全部融化；

6)菌種一級培養(yǎng)：將復(fù)蘇好的菌泥混合液1～2ml直接接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)15～20小時；

7)菌種二級培養(yǎng)：按照2～6％接種量，將一級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液體積占三角瓶容積的40％～60％，三角瓶密封，35℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)15～20小時；

8)菌種三級培養(yǎng)：按照2～6％接種量，將二級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，優(yōu)化培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的40％～60％，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，35℃恒溫培養(yǎng)7～12小時；

9)菌種四級發(fā)酵：按照2～8％接種量，將三級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液接種至裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，優(yōu)化培養(yǎng)基裝液體積占發(fā)酵罐容積的60％～80％，開啟發(fā)酵罐攪拌槳，轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0，35℃恒溫培養(yǎng)，在發(fā)酵開始4小時后，通過流加食品級NaOH溶液來維持菌液的恒pH為5.0±0.1，培養(yǎng)周期9～12小時，直至監(jiān)測到菌液OD₆₀₀值停止增長或呈負(fù)增長，立即停止發(fā)酵；

10)發(fā)酵液離心：四級發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐罐體溫度調(diào)低，當(dāng)罐內(nèi)發(fā)酵液溫度低于20℃時方可準(zhǔn)備離心，離心設(shè)備采用管式離心機，離心前對轉(zhuǎn)鼓進(jìn)行蒸汽滅菌30min，離心轉(zhuǎn)速為10000～15000rpm，離心結(jié)束后，收集轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的菌泥；

11)凍干保護(hù)劑添加：菌泥收集完畢后，按照菌泥：凍干保護(hù)劑＝1:1～2的體積比，添加凍干保護(hù)劑，并攪拌、混合均勻，分裝到凍干機托盤；

12)冷凍干燥：將凍干機托盤放入凍干機內(nèi)進(jìn)行菌粉的凍干，真空度0～1.0Pa，溫度－25℃，持續(xù)凍干53～72小時；

13)凍干粉收集，粉碎、包裝。

2.如權(quán)利要求1所述的一種嗜酸乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，步驟4)中MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液的混合溶液中MRS液體培養(yǎng)基與50％甘油溶液的體積比為1:1～1.5。

3.如權(quán)利要求1所述的一種嗜酸乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，步驟4)中混合溶液與離心前菌懸液的體積比為1:10。

4.如權(quán)利要求1所述的一種嗜酸乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法為：酵母蛋白胨20.0～40.0g/L、葡萄糖15.0～25.0g/L、酵母浸出物5.0～8.0g/L、乙酸鈉4.0～8.0g/L、硫酸鎂0.1～0.3g/L、吐溫80 0.5～0.75g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、檸檬酸1.5～3.0g/L、余量為無菌水，pH值5.60～6.20；按照配方比例稱量、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至5.60～6.20，115℃下滅菌30min。