[發(fā)明專利]一種固定化雙酶耦合反應生產非天然氨基酸產品的工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710114172.5
• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN106636294B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發(fā)明（設計）人: 馬士忠;馬士強;馬道功;劉冰冰;楊召鵬;冀鵬飛;潘艷軍;張龍海;王海洋
• 申請（專利權）人: 濱海瀚鴻生化有限公司
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P39/00;C12P13/04;C12P13/00;C12N11/10;C12N11/082;C12N11/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本專利公開了一種固定化雙酶耦合反應生產非天然氨基酸產品的工藝。以聚乙烯醇、海藻酸鈉和卡拉膠為固定化材料，以硼酸?硼砂?氯化鈣?碳酸鈉體系為交聯(lián)劑，將具有?；负桶被；富钚缘膬煞N基因工程菌按照一定比例混合后共固定化，制備出顆粒狀固定化細胞。以乙?；?DL?氨基酸為原料，在生物反應器中雙酶耦合反應，高效生產非天然氨基酸系列產品。

技術領域

本發(fā)明涉及一種固定化雙酶耦合反應生產非天然氨基酸產品的工藝，屬于生物化學中的酶工程技術領域。

背景技術

非天然氨基酸，是眾多藥物尤其是近十年來眾多新藥的核心中間體，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正纈氨酸，氯吡格雷使用L-2-鄰氯苯甘氨酸，他塔那非使用D-色氨酸，佐米曲坦使用D-脯氨酸，阿扎那韋、特拉匹韋使用L-2-叔亮氨酸，那格列奈、奧曲肽使用D-苯丙氨酸等。

非天然氨基酸主要的生產手段是利用生物酶技術，利用的酶有氨基酰化酶、青霉素?；浮⒑Ｒ蛎福摎涿?，氨基酸氧化酶等。其中氨基酰化酶是主要的方法之一，長期以來用于生產非天然氨基酸。氨基?；赣蠨-氨基酰化酶和L-氨基?；?，其中D-氨基?；复呋阴?D-氨基酸生成D-氨基酸，L-氨基?；复呋阴?L-氨基酸生成L-氨基酸。在工業(yè)上，氨基酰化酶法生產非天然氨基酸的原料為乙?；?DL-氨基酸，因此轉化率只有50%。

專利報道了將?；概c氨基酰化酶混合后偶聯(lián)反應，將DL-乙?；?DL-氨基酸一步轉換為手性氨基酸，轉化率達到了100%。該方法的缺點是使用游離細胞法，不便于重復使用，游離細胞容易破碎，產品成本高，產品質量不穩(wěn)定；如何能夠將生物催化劑重復使用、降低催化劑成本是該技術能否工業(yè)應用的關鍵因素，其中固定化酶或者固定化細胞技術是主要的解決途徑。

固定化細胞技術作為生物工程新技術，具有成本低、污染小、效率高等優(yōu)點。目前固定化技術使用的材料有卡拉膠、海藻酸鈉、樹脂、葡聚糖、聚丙烯酰胺等，固定化細胞材料用于產業(yè)化，理論上要求具有以下特點：容易與細胞或者酶快速混合，并快速凝固；盡量低溫凝固，以避免酶的活性損失；盡量為顆粒狀，便于裝入反應器，以及獲得較好的反應特性；具有較好的強度硬度等機械性能；具有多孔性，具有良好的傳質性能；價格低廉。為了制備具有以上性能的固定化細胞，研究人員通過優(yōu)化固定化材料和制備工藝、選擇優(yōu)質的交聯(lián)劑等方式已經推出各類性能不同的固定化細胞。

聚乙烯醇作為一種新型的生物催化劑包埋固定化載體，具有強度 高、化學穩(wěn)定性好、抗微生物分解性能強、價格低廉等優(yōu)點，但仍存在以下缺點：1.用于交聯(lián)聚乙烯醇的溶液酸性較強，會使固定化細胞活性降低；2.具有高粘性，并且與酸反應較慢，會使滴入時間相差不大的兩液滴粘連，并附聚成團，不易凝膠成球；3.固定化后酶活保留率低，部分對酸敏感的酶會逐漸失活。

因此研究一種好的復配交聯(lián)劑體系，已經成為聚乙烯醇為固定化材料酶法生產非天然氨基酸的重要影響因素。

發(fā)明內容

為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種固定化雙酶耦合一步法反應生產非天然氨基酸產品的工藝。

其特征在于：以聚乙烯醇、海藻酸鈉、卡拉膠的混合物為固定化材料，以硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系為交聯(lián)劑，將具有氨基酰化酶和?；傅幕蚬こ叹旌虾蠊补潭ɑ?，制備出顆粒狀固定化細胞。以乙?；?DL-氨基酸為原料，在生物反應器中利用雙酶耦合反應，一步生產非天然氨基酸系列產品。具體操作工藝如下：

交聯(lián)劑溶液的配制工藝：

在攪拌容器中加入水，加入一定比例的硼酸，硼砂、氯化鈣，碳酸鈉，調整pH即得到交聯(lián)劑溶液。可以根據要求增減部分原料和配比。

細胞共固定化工藝：