[發(fā)明專利]一種固定化雙酶耦合反應(yīng)生產(chǎn)非天然氨基酸產(chǎn)品的工藝

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710114172.5
• 申請(qǐng)日: 2017-02-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106636294B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬士忠;馬士強(qiáng);馬道功;劉冰冰;楊召鵬;冀鵬飛;潘艷軍;張龍海;王海洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濱海瀚鴻生化有限公司
• 主分類號(hào): C12P41/00
• 分類號(hào): C12P41/00;C12P39/00;C12P13/04;C12P13/00;C12N11/10;C12N11/082;C12N11/04
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本專利公開(kāi)了一種固定化雙酶耦合反應(yīng)生產(chǎn)非天然氨基酸產(chǎn)品的工藝。以聚乙烯醇、海藻酸鈉和卡拉膠為固定化材料，以硼酸?硼砂?氯化鈣?碳酸鈉體系為交聯(lián)劑，將具有酰化消旋酶和氨基酰化酶活性的兩種基因工程菌按照一定比例混合后共固定化，制備出顆粒狀固定化細(xì)胞。以乙酰化?DL?氨基酸為原料，在生物反應(yīng)器中雙酶耦合反應(yīng)，高效生產(chǎn)非天然氨基酸系列產(chǎn)品。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種固定化雙酶耦合反應(yīng)生產(chǎn)非天然氨基酸產(chǎn)品的工藝，屬于生物化學(xué)中的酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

非天然氨基酸，是眾多藥物尤其是近十年來(lái)眾多新藥的核心中間體，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正纈氨酸，氯吡格雷使用L-2-鄰氯苯甘氨酸，他塔那非使用D-色氨酸，佐米曲坦使用D-脯氨酸，阿扎那韋、特拉匹韋使用L-2-叔亮氨酸，那格列奈、奧曲肽使用D-苯丙氨酸等。

非天然氨基酸主要的生產(chǎn)手段是利用生物酶技術(shù)，利用的酶有氨基酰化酶、青霉素酰化酶、海因酶，脫氫酶，氨基酸氧化酶等。其中氨基酰化酶是主要的方法之一，長(zhǎng)期以來(lái)用于生產(chǎn)非天然氨基酸。氨基酰化酶有D-氨基酰化酶和L-氨基酰化酶，其中D-氨基酰化酶催化乙酰-D-氨基酸生成D-氨基酸，L-氨基酰化酶催化乙酰-L-氨基酸生成L-氨基酸。在工業(yè)上，氨基酰化酶法生產(chǎn)非天然氨基酸的原料為乙酰化-DL-氨基酸，因此轉(zhuǎn)化率只有50%。

專利報(bào)道了將酰化消旋酶與氨基酰化酶混合后偶聯(lián)反應(yīng)，將DL-乙酰化-DL-氨基酸一步轉(zhuǎn)換為手性氨基酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了100%。該方法的缺點(diǎn)是使用游離細(xì)胞法，不便于重復(fù)使用，游離細(xì)胞容易破碎，產(chǎn)品成本高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定；如何能夠?qū)⑸锎呋瘎┲貜?fù)使用、降低催化劑成本是該技術(shù)能否工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵因素，其中固定化酶或者固定化細(xì)胞技術(shù)是主要的解決途徑。

固定化細(xì)胞技術(shù)作為生物工程新技術(shù)，具有成本低、污染小、效率高等優(yōu)點(diǎn)。目前固定化技術(shù)使用的材料有卡拉膠、海藻酸鈉、樹(shù)脂、葡聚糖、聚丙烯酰胺等，固定化細(xì)胞材料用于產(chǎn)業(yè)化，理論上要求具有以下特點(diǎn)：容易與細(xì)胞或者酶快速混合，并快速凝固；盡量低溫凝固，以避免酶的活性損失；盡量為顆粒狀，便于裝入反應(yīng)器，以及獲得較好的反應(yīng)特性；具有較好的強(qiáng)度硬度等機(jī)械性能；具有多孔性，具有良好的傳質(zhì)性能；價(jià)格低廉。為了制備具有以上性能的固定化細(xì)胞，研究人員通過(guò)優(yōu)化固定化材料和制備工藝、選擇優(yōu)質(zhì)的交聯(lián)劑等方式已經(jīng)推出各類性能不同的固定化細(xì)胞。

聚乙烯醇作為一種新型的生物催化劑包埋固定化載體，具有強(qiáng)度 高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物分解性能強(qiáng)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在以下缺點(diǎn)：1.用于交聯(lián)聚乙烯醇的溶液酸性較強(qiáng)，會(huì)使固定化細(xì)胞活性降低；2.具有高粘性，并且與酸反應(yīng)較慢，會(huì)使滴入時(shí)間相差不大的兩液滴粘連，并附聚成團(tuán)，不易凝膠成球；3.固定化后酶活保留率低，部分對(duì)酸敏感的酶會(huì)逐漸失活。

因此研究一種好的復(fù)配交聯(lián)劑體系，已經(jīng)成為聚乙烯醇為固定化材料酶法生產(chǎn)非天然氨基酸的重要影響因素。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種固定化雙酶耦合一步法反應(yīng)生產(chǎn)非天然氨基酸產(chǎn)品的工藝。

其特征在于：以聚乙烯醇、海藻酸鈉、卡拉膠的混合物為固定化材料，以硼酸-硼砂-氯化鈣-碳酸鈉體系為交聯(lián)劑，將具有氨基酰化酶和酰化消旋酶的基因工程菌混合后共固定化，制備出顆粒狀固定化細(xì)胞。以乙酰化-DL-氨基酸為原料，在生物反應(yīng)器中利用雙酶耦合反應(yīng)，一步生產(chǎn)非天然氨基酸系列產(chǎn)品。具體操作工藝如下：

交聯(lián)劑溶液的配制工藝：

在攪拌容器中加入水，加入一定比例的硼酸，硼砂、氯化鈣，碳酸鈉，調(diào)整pH即得到交聯(lián)劑溶液。可以根據(jù)要求增減部分原料和配比。

細(xì)胞共固定化工藝：