[發(fā)明專利]一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測PQQ對(duì)乳酸作用的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710110897.7
• 申請(qǐng)日: 2017-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN106841452B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周杏琴;毛師師;徐希杰;欽曉峰;鄒美芬;徐棟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/74
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;張仕婷

1.一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測PQQ對(duì)乳酸作用的方法，其特征在于步驟為：

（1）UPLC分析條件

ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column 2.1×100mm,1.7μm，流動(dòng)相A：H₂O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脫5min，20 min梯度洗脫至75/25 B/A；檢測波長322nm；

（2）波長的確定

稱取一定量的PQQ及乳酸，分別用0.1M鹽酸溶液溶解，配制成1mM 的PQQ溶液及1mM 的乳酸溶液，按v/v為1︰5混合，避光，于37℃水浴孵育24h，冰浴終止反應(yīng)；紫外掃描圖顯示322nm紫外吸收較高；選擇322nm 作為檢測波長；

（3）流動(dòng)相組分對(duì)分離的影響

在流動(dòng)相中分別添加三氟乙酸TFA質(zhì)量百分比為：0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3 %TFA試驗(yàn)，當(dāng)TFA含量為0.2%時(shí)，流動(dòng)相A：H₂O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脫5min，20 min梯度洗脫至75/25 B/A；各組份峰型對(duì)稱性較好，PQQ與3種生成物都能達(dá)到基線分離；

（4）UPLC-MS 對(duì)PQQ與乳酸的反應(yīng)產(chǎn)物的定性分析

采用ACQUiTY UPLC@ BEH C18 column 2.1×100mm,1.7μm，質(zhì)譜檢測器SQ Detector 2及PDA檢測器，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：

脫溶劑氣溫度：400℃；

脫溶劑氣流量：600 L/h；

離子源溫度：110℃；

錐孔氣流量：50L/h；

毛細(xì)管電壓：3000 V；

錐孔電壓：30V；

質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式ESI+，質(zhì)量掃描范圍為m/z 50～800；

流動(dòng)相A：H₂O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95 B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25 B/A；進(jìn)樣10μL，反應(yīng)液的ESI-MS譜圖中，主要離子為m/z 403, 475, 547三個(gè)峰；通過產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子分析PQQ分別與一分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1，403，M+1峰，330，M-72 乳酸峰；與二分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa2，475，M+1峰，402，M-72 乳酸峰；與三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa3，547，M+1峰；

三種產(chǎn)物的積分面積比值PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3為9.6/1.6/1；

（5）3種產(chǎn)物峰面積AUS隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線

將PQQ與乳酸分別配制以摩爾比為1︰5混合反應(yīng)，避光，充分?jǐn)嚢?，置?7℃水浴孵育，于4、8、16、24、32、48h各時(shí)間點(diǎn)抽取反應(yīng)液，甲醇稀釋直接進(jìn)樣進(jìn)行UPLC-MS分析；采集【M+1】⁺分別為403，475，547的積分面積AUS，用AUS對(duì)時(shí)間作圖，反應(yīng)24h后基本處于穩(wěn)定；

（6）PQQ對(duì)D-半乳糖D-gal誘導(dǎo)大鼠衰老模型生物樣本中乳酸含量的影響測定

采用熒光增強(qiáng)試劑4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑NBD-COCl反應(yīng)生成響應(yīng)值較大的熒光物質(zhì)，來檢測生物樣本中含量極低的La，最低檢測濃度達(dá)10nM；

色譜條件：美國WATERS 600高效液相色譜儀，2175熒光檢測器，色譜柱Amethyst C18-H4.6×250mm、5μm，流動(dòng)相15%乙腈-H₂O 含0.05%TFA，流速1mL/min，熒光檢測激發(fā)波長483nm，發(fā)射波長530nm；

血漿或細(xì)胞外液處理：10μL血漿/細(xì)胞外液+10μL去離子水+180μL甲醇，充分混勻，15000rpm/4℃離心5min，10μL上清液冷凍干燥，干燥物溶解在10μL去離子水中直接用于衍生反應(yīng)；

腦組織處理：腦組織稱重取0.1g，加入0.9mL預(yù)冷的生理鹽水，電動(dòng)勻漿，15000rpm/4℃離心15min，取10μL上清液+10μL去離子水+180μL甲醇，充分混勻，15000rpm/4℃離心5min，10μL上清液冷凍干燥，干燥物溶解在10μL去離子水中直接用于衍生反應(yīng)；

衍生反應(yīng)：10μL樣本+10μL 50mM N-甲基嗎啉+5 μL 20mM NBD-COCl，60℃反應(yīng)15min，加150μL 2%TFA終止反應(yīng)，取10μL直接進(jìn)行HPLC分析；

線性關(guān)系與檢測限測定：精密稱取乳酸對(duì)照品，加去離子水配成0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50mmol/L的對(duì)照溶液，按上述衍生反應(yīng)方法反應(yīng)后進(jìn)行HPLC分析；所得積分面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得方程式y(tǒng) =1602534x + 18831，R² = 0.9999；在0.1～50mmol/L范圍內(nèi)線性良好，最小檢出濃度為10nM，X為濃度mmol/L，Y為峰面積；

重復(fù)性和精確度的測定：在確定的色譜條件下于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測定，根據(jù)峰面積計(jì)算所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，n=6，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.84%，n=6；

生物樣本中乳酸含量的測定：各組樣本按上述方法處理后按上述反應(yīng)條件衍生反應(yīng)后進(jìn)行HPLC分析，外標(biāo)法計(jì)算得到乳酸的含量，結(jié)果為：D-gal誘導(dǎo)衰老模型鼠血漿、腦組織和細(xì)胞外液中乳酸含量顯著升高，PQQ給藥組乳酸含量顯著下降。