[發(fā)明專利]一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測PQQ對乳酸作用的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710110897.7
• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN106841452B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周杏琴;毛師師;徐希杰;欽曉峰;鄒美芬;徐棟
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/74
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種HPLC結(jié)合UPLC?MS檢測PQQ對乳酸作用的方法，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用UPLC方法研究了PQQ與乳酸的反應(yīng)，優(yōu)化了分離條件，使PQQ與多個反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)到分離。并采用UPLC?MS對其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。本發(fā)明首次研究PQQ與乳酸的反應(yīng)行為，在反應(yīng)液中發(fā)現(xiàn)了3種產(chǎn)物，其準(zhǔn)分子離子【M+H】⁺分別為403，475及547。PQQ分別與一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通過不同反應(yīng)時間各生成物的峰面積發(fā)現(xiàn)主要以PQQLa1存在，酯化后的產(chǎn)物透過血腦屏障進(jìn)入細(xì)胞外液，由此降低了細(xì)胞外液乳酸的含量。對研究PQQ在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，尤其與衰老有關(guān)的疾病研究方面具有極為重要的研究價值。

技術(shù)領(lǐng)域

一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測PQQ對乳酸作用的方法，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的能量供應(yīng)主要依賴外周血中的葡萄糖。血腦屏障中的主要成份星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取葡萄糖，經(jīng)糖酵解產(chǎn)生乳酸釋放至細(xì)胞外液，細(xì)胞外液反映神經(jīng)細(xì)胞的生存環(huán)境。乳酸作為糖酵解的代謝產(chǎn)物，一直被認(rèn)為對神經(jīng)細(xì)胞有損害作用。因此，乳酸在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用一直為科學(xué)家所重視。已有報道急性腦外傷病人腦脊液乳酸含量升高；正常人腦脊液乳酸含量很低，報道發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤中乳酸含量明顯升高；血清乳酸已作為腦損傷的生物標(biāo)志物。美國科學(xué)院院刊PANS也報道了乳酸濃度的上升與衰老有關(guān)，這可能是線粒體DNA機(jī)能障礙引發(fā)小鼠大腦的代謝變化，由此改變控制乳酸形成的特定基因的表達(dá)，這種變化導(dǎo)致了大腦乳酸濃度增加。因此，檢測乳酸濃度對探測中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與衰老有關(guān)的疾病具有重要意義，加速腦內(nèi)乳酸代謝、降低乳酸的含量維持乳酸低濃度是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個重要手段。

吡咯并喹呤醌(PQQ)是一種氧化還原酶輔基，其結(jié)構(gòu)式為：

其能夠減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，在腦中能夠促進(jìn)神經(jīng)因子的產(chǎn)生對神經(jīng)細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。PQQ在神經(jīng)系統(tǒng)方面的重要功能可能與其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，具有多羰基和多羧基的官能團(tuán)，能夠與多種活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。比如能夠與多種氨基酸發(fā)生反應(yīng)因而對氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用。而是否對與衰老基因有關(guān)的重要因素乳酸具有調(diào)節(jié)作用，至今無相關(guān)報道。

本發(fā)明采用UPLC方法研究了PQQ與乳酸的反應(yīng)，優(yōu)化了分離條件，使PQQ與多個反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)到分離。并采用UPLC-MS對其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。以往的研究顯示PQQ結(jié)構(gòu)中的兩個羰基與氨基酸參與縮合反應(yīng)生成惡唑類化合物，本文首次研究PQQ與乳酸的反應(yīng)行為，在反應(yīng)液中發(fā)現(xiàn)了3種產(chǎn)物，其準(zhǔn)分子離子【M+H】⁺分別為403，475和547。通過產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子初步分析PQQ分別與一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通過不同反應(yīng)時間各生成物的峰面積發(fā)現(xiàn)主要以一分子酯化產(chǎn)物PQQLa1存在，酯化后的產(chǎn)物透過血腦屏障進(jìn)入細(xì)胞外液，由此降低了細(xì)胞外液乳酸的含量。對研究PQQ在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，尤其與衰老有關(guān)的疾病研究方面具有極為重要的研究價值。

乳酸含量的測定有比色法、EDTA滴定法、HPLC分析法、酶法、GC分析法，比色法及EDTA方法簡單、快速，但靈敏度及精密度差；酶法對實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻而且費(fèi)用高；氣相色譜法中乳酸易發(fā)生分解，影響其測定準(zhǔn)確性。腦組織中乳酸含量極低，乳酸的紫外吸收極低，文獻(xiàn)報道的HPLC法大多采用210nm檢測，干擾因素較多，報道的最低檢測濃度5μM，對于腦組織生物樣本檢測靈敏度太低。本發(fā)明采用熒光增強(qiáng)試劑NBD-COCl（4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑），與乳酸反應(yīng)生成響應(yīng)值較大的熒光物質(zhì)，測定了PQQ對D-gal（D-半乳糖）誘導(dǎo)大鼠衰老模型生物樣本中乳酸含量的影響，最低檢測濃度達(dá)10nM。測定結(jié)果顯示PQQ能降低因D-gal引起的衰老模型大鼠血漿、腦組織及細(xì)胞外液乳酸含量的升高，對PQQ抗衰老的機(jī)理研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容