[發明專利]基于桿狀病毒表達系統制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法

有效

• 申請號: 201710109641.4
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106834352B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 貢成良;曹廣力;胡小龍;薛仁宇;劉波;李坤
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/04;A61K39/245;A61P31/22;C12N15/62
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒;孫周強

本發明涉及抗原蛋白表達技術，具體涉及基于桿狀病毒表達系統制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法，通過設計重組家蠶核型多角體病毒BmNPV?VP3?cyHV?polh，ORF72、ORF66、ORF81和ORF82的1?186、993?1197、603?783、85?186區域序列與家蠶質型多角體病毒結構蛋白VP3基因1?279區域的編碼序列串聯融合序列由桿狀病毒P10啟動子控制；家蠶質型多角體蛋白基因由桿狀病毒的多角體蛋白基因啟動子控制。用該病毒接種家蠶或家蠶培養細胞，重組病毒表達的鯉皰疹病毒II型的抗原蛋白可包裹進家蠶質型多角體內。形成的多角體可以通過簡單的差速離心實現純化；純化的多角體在堿性條件下裂解后，可以通過離心使多角體蛋白沉淀，而鯉皰疹病毒II型抗原留存在上清中，從而可以快速、方便地獲得鯉皰疹病毒II型抗原。

技術領域

本發明涉及病毒基因工程技術領域，具體涉及基于桿狀病毒表達系統制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法。

背景技術

異育銀鯽鰓出血病由鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）感染引起，目前有關該病的防治主要從增強魚的免疫能力、減少應激反應、混養、減少養殖密度、加強疾病的檢測、及時去除患病魚等方面進行控制。一般認為免疫預防是魚類病毒性疾病防治最有效的方法之一。目前，魚類的疫苗主要有滅活疫苗（死疫苗）、減毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗以及蛋白亞單位/DNA聯合疫苗。滅活疫苗制備相對較容易，但免疫原性差，需含足夠量的滅活病毒才能引起有效免疫應答，且該類疫苗不能進入主要組織相容性復合體I(MHC I)類抗原呈遞途徑,不能有效誘導細胞毒性T細胞（CTL）反應,因此，免疫效果相對不理想、免疫力持久性差。減毒疫苗免疫力強、作用時間長，但減毒疫苗生產成本高，有毒力返祖現象，安全性較差，有回復致病性的潛在危險。亞單位疫苗具有抗原性強、保護時間長、安全性好、制備和運輸方便等優點，但是存在抗原表位丟失的不足，因此，新一代疫苗的研發方向是DNA疫苗；但至今沒有有效的CyHV-2的DNA疫苗。

通過基因工程生產的多抗原蛋白亞單位聯合疫苗可以防治因病毒突變而導致的免疫逃逸，免疫保護效果好。目前基因工程疫苗絕大多數是通過大腸桿菌表達系統生產，盡管大腸桿菌表達系統表達外源蛋白技術相對較成熟，但獲取大量的純重組蛋白仍存在缺陷。另外由于大腸桿菌不具有翻譯后的修飾系統，往往導致重組蛋白的免疫原性較差、且細胞周質中含有種類繁多的內毒素。因此，有必要尋找新的表達系統。

免疫的劑型不僅影響免疫效果，也影響免疫保護期。已有研究表明，海藻酸鈉載藥微球作為新型緩控釋制劑，可增強抗原的免疫活性。但海藻酸鈉抗原微球的制備工藝較復雜，影響因素較多；質型多角體是昆蟲質型多角體病毒在感染細胞內形成的一種包埋有病毒粒子的蛋白質多面體結晶。

因此，通過桿狀表達系統制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體有可能作為良好的疫苗，但到目前為止，還沒有相關研究報道。

發明內容

本發明的發明目的是提供一種基于桿狀病毒表達系統制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法；用質型多角體蛋白包裹的抗原穩定性好，不易被降解；純化包裹在質型多角體內的抗原蛋白的方法簡便；無核酸污染，生物安全性較高。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種基于桿狀病毒表達系統制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法，包括下列步驟：

（1）將家蠶質型多角體病毒多角體蛋白基因克隆進pFastBacDual質粒的EcoRI 和XbaI之間，構建重組轉移pFastBacDual-polh質粒；

（2）合成融合DNA序列；所述融合DNA序列如SEQ ID NO:3所示；