[發(fā)明專利]基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710109641.4
• 申請(qǐng)日: 2017-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106834352B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 貢成良;曹廣力;胡小龍;薛仁宇;劉波;李坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/866
• 分類號(hào): C12N15/866;C12N7/04;A61K39/245;A61P31/22;C12N15/62
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒;孫周強(qiáng)

1.一種基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法，其特征在于，包括下列步驟：

（1）將家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體蛋白基因克隆進(jìn)pFastBacDual質(zhì)粒的EcoRI 和XbaI之間，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移pFastBacDual-polh質(zhì)粒；

（2）合成融合DNA序列；所述融合DNA序列如SEQ ID NO:3所示；

（3）將步驟（2）的融合DNA序列克隆進(jìn)步驟（1）的pFastBacDual-polh質(zhì)粒的XhoI和KpnI位點(diǎn)，獲得pFast-VP3-cyHV-polh質(zhì)粒；

（4）將步驟（3）的pFast-VP3-cyHV-polh質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含培養(yǎng)基的瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)，挑取白色菌落，提取重組Bacmid-VP3-cyHV-polh DNA；

（5）將步驟（4）的重組Bacmid-VP3-cyHV-polh DNA轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26～27℃培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)病后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲重組病毒BmNPV- VP3-cyHV-polh；

（6）將步驟（5）的重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接種家蠶或家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)病后，收集家蠶血淋巴或家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，純化多角體，獲包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體；

步驟（4）中，所述感受態(tài)細(xì)胞為DH10/Bac感受態(tài)細(xì)胞；所述培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基添加四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、X-gal、IPTG得到，四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG 和X-gal在LB瓊脂平板上的含量分別為10 μg/ml、50 μg/ml、7 μg/ml、40μg/ml和100 μg/ml；步驟（6）中，首先將步驟（5）的重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh再次轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26～27℃培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)病后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲二代重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh；然后將二代重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接種家蠶；所述家蠶為4～5齡幼蟲(chóng)或蠶蛹。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法，其特征在于，步驟（1）中，以家蠶質(zhì)型多角體病毒的基因組RNA或家蠶質(zhì)型多角體病毒感染的中腸組織的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體蛋白基因。