[發(fā)明專利]基于HRM技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及引物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710109068.7
• 申請(qǐng)日: 2017-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106811530A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車團(tuán)結(jié);同重湘;尤崇革;謝小冬;李琳;李亞鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州百源基因技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京三聚陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11250
• 代理人: 李敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體涉及一種基于HRM技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及其引物、應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)核病是當(dāng)今全球范圍對(duì)人類最具有威脅性的感染性疾病之一，而耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB)以及廣泛耐藥結(jié)核病(extensive drug resistant tuberculosis,XDR-TB)的出現(xiàn)使得結(jié)核病的流行態(tài)勢(shì)更為嚴(yán)峻。WHO2008報(bào)道顯示，全球結(jié)核病總耐藥率為20.0％，耐多藥率為5.3％，每年新出現(xiàn)耐多藥結(jié)核病患者約50萬(wàn)人，廣泛耐藥結(jié)核病患者5萬(wàn)人。隨著世界范圍內(nèi)人口流動(dòng)的增加，耐藥性結(jié)核病例過(guò)去20年來(lái)一直呈上升態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重地威脅著結(jié)核病控制工作的進(jìn)展。

鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇屬于世界衛(wèi)生組織推薦的抗結(jié)核一線藥物，對(duì)結(jié)核病的治療具有非常重要的作用，及時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌對(duì)鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇的耐藥性檢測(cè)可指導(dǎo)臨床用藥，避免延誤治療。結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核化療藥物異煙肼(INH)的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，約92％的INH耐藥菌與katG，inhA和ahpC三個(gè)基因突變有關(guān),其中katG和inhA基因是主要的耐藥基因,katG的丟失或突變導(dǎo)致其編碼的過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶活性喪失或下降，而inhA基因突變減弱了異煙肼對(duì)分枝桿菌酸生物合成的抑制作用；結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇與阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因，embABC操縱子突變或emb蛋白表達(dá)增高有關(guān)，該操縱子由embC、embA和embB三個(gè)基因組成，其中embB基因(尤其是306位密碼子)突變是耐乙胺丁醇產(chǎn)生的主要分子機(jī)制；鏈霉素耐藥是由于其核糖體S12蛋白編碼基因rpsL或16SrRNA編碼基因rr8突變所致，80％耐鏈霉素結(jié)核分枝桿菌臨床分離株可見(jiàn)rpsL突變。

結(jié)核分枝桿菌的臨床檢測(cè)一直以來(lái)主要依靠藥物藥敏試驗(yàn)，但傳統(tǒng)的在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行的藥物敏感試驗(yàn)周期長(zhǎng)、敏感性低，嚴(yán)重影響了患者的早期診斷和治療。基因芯片樣本的制備和標(biāo)記較繁瑣，儀器昂貴，檢測(cè)成本高。PCR-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析只能分析已知序列特異位點(diǎn)的基因突變。快速培養(yǎng)儀檢測(cè)系統(tǒng)儀器和試劑依賴進(jìn)口費(fèi)用高昂。

高分辨溶解曲線(High Resolution Melting，HRM)技術(shù)是一種新興的檢測(cè)技術(shù)，HRM技術(shù)是在常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過(guò)程中飽和熒光染枓如Eva Green與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)通過(guò)加熱升溫使DNA雙鏈解離時(shí)，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，由于突變、SNP位點(diǎn)雙鏈堿基間不匹配會(huì)使雙鏈DNA在此位點(diǎn)首先解開(kāi)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中的熒光強(qiáng)度，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間軸曲線上便可判斷是否存在突變或SNP。不同位點(diǎn)、雜合子與否、GC含量、擴(kuò)增子長(zhǎng)度等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，所以HRM分析能夠有效區(qū)分不同突變位點(diǎn)、SNP位點(diǎn)和擁有不同GC含量的擴(kuò)增片段。其操作方法簡(jiǎn)便，樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM，PCR產(chǎn)物無(wú)需轉(zhuǎn)入其它分析裝置，可直接在同一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)閉管式操作，不會(huì)產(chǎn)生氣溶膠污染。是一種可以快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高和避免交叉污染的檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)周期長(zhǎng)、敏感度低的問(wèn)題，從而提供一種基于HRM技術(shù)快速準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒，以準(zhǔn)確可靠、快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性及多重耐藥性。

本發(fā)明提供了一種基于HRM技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組，所述引物組包含至少一種選自以下的引物組：

引物組1：包含堿基序列如SEQ NO.1所示的引物katG315-F和堿基序列如SEQ NO.2所示的引物katG315-R；

引物組2：包含堿基序列如SEQ NO.3所示的引物inhA94-F和堿基序列如SEQ NO.4所示的引物inhA94-R；

引物組3：包含堿基序列如SEQ NO.5所示的引物rpsL43-F和堿基序列如SEQ NO.6所示的引物rpsL43-R；

引物組4：包含堿基序列如SEQ NO.7所示的引物embB330-F和堿基序列如SEQ NO.8所示的引物embB330-R；

引物組5：包含堿基序列如SEQ NO.9所示的引物embB630-F和堿基序列如SEQ NO.10所示的引物embB630-R。

所述引物組特異性識(shí)別結(jié)核分枝桿菌耐藥性基因包括katG基因、inhA基因、rpsL基因和embB基因。