[發明專利]基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及引物

在審

• 申請號: 201710109068.7
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106811530A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 車團結;同重湘;尤崇革;謝小冬;李琳;李亞鵬
• 申請（專利權）人: 蘇州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司11250
• 代理人: 李敏

1.基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組，其特征在于，所述引物組包含至少一種選自以下的引物組：

引物組1：包含堿基序列如SEQ NO.1所示的引物katG315-F和堿基序列如SEQ NO.2所示的引物katG315-R；

引物組2：包含堿基序列如SEQ NO.3所示的引物inhA94-F和堿基序列如SEQ NO.4所示的引物inhA94-R；

引物組3：包含堿基序列如SEQ NO.5所示的引物rpsL43-F和堿基序列如SEQ NO.6所示的引物rpsL43-R；

引物組4：包含堿基序列如SEQ NO.7所示的引物embB330-F和堿基序列如SEQ NO.8所示的引物embB330-R；

引物組5：包含堿基序列如SEQ NO.9所示的引物embB630-F和堿基序列如SEQ NO.10所示的引物embB630-R。

2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組特異性識別結核分枝桿菌耐藥性基因包括katG基因、inhA基因、rpsL基因和embB基因。

3.根據權利要求2所述的引物組，其特征在于，所述引物組1特異性識別katG基因，所述引物組2特異性識別inhA基因，所述引物組3特異性識別rpsL基因，所述引物組4特異性識別embB基因，所述引物組5特異性識別embB基因。

4.一種基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-3任一項所述的基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組。

5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，還包括非標記熒光PCR反應液、陰性標準品和陽性標準品。

6.根據權利要求4-5所述試劑盒，其特征在于，所述非標記熒光PCR反應液包括以下組分：

Green-2-Go qPCR Mastermix，5μl

引物F，10μM，0.1μl

引物R，10μM，0.1μl

ddH₂O，4.3μl。

7.權利要求1-3任一項所述的引物組或權利要求4-6任一項所述的試劑盒在結核分枝桿菌耐藥基因預定位點進行突變檢測的應用，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的基因組DNA；

(2)使用權利要求1-3任一項所述的引物組或權利要求4-6任一項所述的試劑盒對所述基因組DNA進行非標記熒光PCR擴增；

(3)對PCR擴增產物進行HRM分析，判定所述結核分枝桿菌耐藥基因預定位點是否發生突變。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述耐藥基因的預定位點包括：katG基因315位點、inhA基因94位點、rpsL基因43位點、embB基因330位點和embB基因630位點。

9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述非標記熒光PCR 擴增的程序：94℃預變性3min，94℃變性10s，60℃退火/延伸20s；所述HRM分析的程序：94℃變性90s，60℃復性30sec，熔解溫度以0.06℃/s從83℃升至94℃，并在熔解過程中實時檢測熒光信號。

10.一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、取待測樣品進行液化和培養，然后提取待測樣品中的基因組DNA；

b、使用權利要求4-6任一項所述的試劑盒中的非標記熒光混合液分別對陰性標準品、陽性標準品和待測樣品的基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應程序為：94℃預變性3min，94℃變性10s，60℃退火/延伸20s；

c、收集重組陰性質粒、重組陽性質粒和待測樣品的熒光數據，進行HRM分析，HRM分析程序：94℃變性90s，60℃復性30sec，熔解溫度以0.06℃/s從83℃升至94℃，并在熔解過程中實時檢測熒光信號。