[發明專利]定量保存微生物的冷凍干燥小球的制備方法

有效

• 申請號: 201710108142.3
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106929421B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 傅博強;陳敏璠;林婧;張玲;隋志偉;王晶
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04
• 代理公司: 北京慧誠智道知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11539
• 代理人: 李楠

本發明實施例涉及一種定量保存微生物的冷凍干燥小球的制備方法，所述制備方法包括：將目標菌株經營養瓊脂接種及單菌落營養肉湯增菌后，獲取對數生長期后期的微生物菌液；將微生物菌液進行稀釋，并使用600nm波長的光吸收輔助控制菌濃度，獲得定量濃度的均勻菌懸液；將保護劑與無菌水混合配成保護劑溶液；將菌懸液與保護劑溶液進行混合，得到混合液；其中，混合液的菌濃度為10²cfu/50μl～10⁶cfu/50μl；取定量的混合溶液，利用液氮將混合溶液冷凍成球，然后迅速進行預凍；其中，預凍時間不少于2小時，預凍溫度為?80℃～?20℃；將預凍后的小球進行真空冷凍干燥，得到冷凍干燥小球。

技術領域

本發明涉及微生物冷凍技術領域，尤其涉及一種定量保存微生物的冷凍干燥小球的制備方法。

背景技術

由于培養基品質、培養條件、菌液混勻程度、微生物吸附損失、吸取液體體積、菌落計數準確性、不同人員操作差異性等，微生物活菌的定量結果有很大的不確定性。

衛監督發〔2010〕29號《食品檢驗機構資質認定條件》第七章儀器設備和標準物質中規定，第二十五條食品檢驗機構應當配備滿足所開展的檢驗活動必需的儀器設備、樣品前處理裝置以及標準物質(參考物質)或標準菌(毒)種等。第二十六條食品檢驗機構使用儀器設備(包括軟件)、標準物質(參考物質)或標準菌(毒)種等有專人管理，滿足溯源要求。因此，為保證微生物定量結果的準確與可比，需要在微生物計數過程中使用定量標準物質。

目前已有的市售質控菌株，多數是以凍干粉的形式存在，且多用于定性。因此需要一種能準確控制菌數，穩定性好，使用便捷的菌株定量制備保藏方法。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術所存在的缺陷，提供一種定量保存微生物的冷凍干燥小球的制備方法，能夠制備出含菌量50～10⁸CFU/球的冷凍干燥小球，且冷凍干燥小球間菌數的相對標準偏差小于25％，能在-20℃保持至少3個月，-80℃保持至少6個月的穩定性。此外，該工藝簡單，成本低，此方法使用本制備方法所得的冷凍干燥小球外觀完整，數量可控，穩定性佳，復溶性好，無需復活即可直接使用，有廣泛的應用前景。

為實現上述目的，本發明提供了一種定量保存微生物的冷凍干燥小球的制備方法，包括：

將目標菌株經營養瓊脂接種及單菌落營養肉湯增菌后，獲取對數生長期后期的微生物菌液；

將所述微生物菌液進行稀釋，并使用600nm波長的光吸收輔助控制菌濃度，獲得定量濃度的均勻菌懸液；

將保護劑與無菌水混合配成保護劑溶液；其中，所述保護劑溶液中包括5g/ml～20g/ml的蛋白質、2g/ml～15g/ml的水溶性糖、0.5g/ml～10g/ml的谷氨酸鈉和0g/ml～5g/ml的表面活性劑；

將所述菌懸液與所述保護劑溶液進行混合，得到混合液；其中，所述混合液的菌濃度為10²cfu/50μl～10⁶cfu/50μl；

取定量的所述混合溶液，利用液氮將所述混合溶液冷凍成球，然后進行預凍；其中，所述預凍時間不少于2小時，預凍溫度為-80℃～-20℃；

將所述預凍后的小球進行真空冷凍干燥，得到所述冷凍干燥小球。

優選的，所述將預凍后的小球進行真空冷凍干燥，得到所述冷凍干燥小球具體為：

將預凍后的小球在-50℃～-35℃保存4小時～6小時進行定型，使所述小球內的水分部分升華；

再將所述小球在-35℃～-20℃進行主干燥；其中，所述主干燥的時間為8小時～12小時；

將所述主干燥后的小球在10℃～25℃進行解析干燥；其中，所述解析干燥的時間為7小時～10小時。