[發(fā)明專利]使用切口酶的解旋酶依賴性等溫擴增

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710107030.6
• 申請日: 2011-08-16
• 公開（公告）號: CN107012205A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 克里斯蒂安·科夫哈格;戈爾德·格洛豪瑟;托馬斯·羅特曼;拉爾夫·希默爾賴希
• 申請（專利權(quán)）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司11219
• 代理人: 楊青,穆德駿

1.用于擴增模板核酸的非診斷性方法，

其中所述方法包括在切口核酸內(nèi)切酶存在下使用解旋酶依賴性擴增(HDA)反應(yīng)擴增所述模板核酸，并且

其中所述模板核酸包含由所述切口核酸內(nèi)切酶識別的序列，或者在HDA反應(yīng)期間由所述切口核酸內(nèi)切酶識別的序列被引入到模板核酸中，其中HDA反應(yīng)是嗜熱的HDA(tHDA)，其中使用包含由切口核酸內(nèi)切酶識別的序列的寡核苷酸引物將由切口核酸內(nèi)切酶識別的序列引入到模板核酸中，并且其中擴增的序列短于400bp，以及

其中所述切口核酸內(nèi)切酶是指識別完全或部分雙鏈的核酸分子的核苷酸序列并在相對于識別序列而言的特定位置處只切割核酸分子的一條鏈的核酸內(nèi)切酶，其中包含由切口核酸內(nèi)切酶識別的序列的所述引物包含不與模板核酸雜交的5’標簽序列，并且由切口核酸內(nèi)切酶識別的序列處于所述標簽序列中，

并且其中所述方法還包括初始的熱變性步驟。

2.權(quán)利要求1的方法，其中模板核酸是雙鏈模板核酸。

3.權(quán)利要求1的方法，其中解旋酶選自：超家族I解旋酶；超家族II解旋酶；超家族III解旋酶；來自于dnaB樣超家族的解旋酶；以及來自于rho樣超家族的解旋酶。

4.權(quán)利要求1的方法，其中聚合酶選自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。

5.權(quán)利要求1的方法，其中切口核酸內(nèi)切酶選自Nb.BsmI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI和Nt.AlwI。

6.權(quán)利要求1的方法，其中在超過50℃的溫度下執(zhí)行HDA擴增反應(yīng)。

7.權(quán)利要求1的方法，其還包括檢測擴增產(chǎn)物的步驟。

8.權(quán)利要求7的方法，其中使用凝膠電泳、嵌入染料或特異性寡核苷酸探針來檢測擴增產(chǎn)物。