[發明專利]使用切口酶的解旋酶依賴性等溫擴增

在審

• 申請號: 201710107030.6
• 申請日: 2011-08-16
• 公開（公告）號: CN107012205A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 克里斯蒂安·科夫哈格;戈爾德·格洛豪瑟;托馬斯·羅特曼;拉爾夫·希默爾賴希
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司11219
• 代理人: 楊青,穆德駿

本申請為國際申請日2011年8月16日、國際申請號PCT/EP2011/064114于2013年2月16日進入中國國家階段、申請號201180039588.6、發明名稱“使用切口酶的解旋酶依賴性等溫擴增”的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物學和化學領域，特別是屬于分子生物學領域。更具體地，本發明涉及用于擴增核酸的方法和試劑盒。

背景技術

核酸擴增被廣泛用在研究、診斷學、法醫學、醫學、食物科學和農業中。“現場即時測試(Point of Care Testing)”(POCT)是指在患者醫療點處或附近進行的診斷性測試，即去集中化的檢查，例如可以在私人醫療實踐、小醫院、藥店中或者甚至在事故或其它醫療緊急事件的現場或位點處或者在救護車內執行所述檢查。現場即時診斷需要快速且簡單的測試。因此，在基于核酸的檢測方法的情況下，與已建立的但較慢的基于PCR的方法相比，快速等溫擴增技術最近已變得越來越重要。PCR需要熱循環，以便將雙鏈核酸例如DNA的兩條鏈分離開。相反，例如等溫擴增方法不需要熱循環儀。

最杰出的等溫擴增方法之一是所謂的解旋酶依賴性擴增(HDA)(例如被描述在Vincent等.(2004)，EMBO reports 5(8):795-800；Jeong等.(2009)，Cell.Mol.Life Sci 66:3325-3336；WO-A2 2004/027025；WO-A2 2006/074334中，所有均通過參考結合于此)。HDA是基于解旋酶將雙鏈核酸特別是DNA解旋的能力，而不需要加熱或甚至熱循環。在HDA中，使用DNA聚合酶和合適的寡核苷酸引物來復制分離的DNA鏈。因此，HDA模擬天然的復制叉機制。HDA需要存在ATP、二價鎂離子和dNTP。某些基于HDA的方法還采用單鏈結合蛋白(SSB)來包被置換的DNA鏈。事實上，取決于所使用的酶，可以在熱不穩定或熱穩定的反應中執行HDA方法。典型地，在25℃和50℃之間、優選在37℃和42℃之間的溫度下執行熱不穩定的HDA反應。相反，在超過50℃、典型地在60℃和70℃之間的溫度下執行熱穩定的HDA或嗜熱的HDA(tHDA)反應。

HDA反應選擇性地擴增由兩個引物限定的靶序列。HDA使用解旋酶而不是像PCR中那樣使用熱來將雙鏈核酸的兩條鏈分離開。因此，可以在單個溫度下執行HDA，而不需要熱循環。常規的標準HDA反應的步驟示于圖1中：在第一個步驟中，通過解旋酶將雙鏈核酸解旋，產生(部分)單鏈的序列。然后，引物與單鏈區結合。在步驟2中，聚合酶合成互補鏈。最后，解旋酶和聚合酶共同起作用，導致模板的擴增(步驟3)。

其它等溫擴增包括鏈置換擴增(SDA)，鏈置換擴增是基于使用限制性酶在DNA的未修飾鏈上造成切口并通過核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶的作用來延伸切口處的3’末端以置換下游的DNA鏈。

另一種等溫擴增是滾環擴增(RCA)，其中線性ssDNA被退火到環狀ssDNA模板上，所述環狀ssDNA模板是通過使用DNA連接酶連接模板DNA的兩個末端而生成的。接著，使用DNA聚合酶延伸退火的引物，并生成互補模板序列的串聯連接的拷貝。RCA和SDA兩者都需要初始的熱變性步驟。

其它等溫擴增包括例如切口酶擴增反應(NEAR)和相關的指數擴增反應(EXPAR)，兩者都采用切口酶和聚合酶來擴增短的雙鏈模板序列(例如被描述在van Ness等.(2003)，Proc.Natl.Acad.Sci.100(8):4504-4509；US-A1 2003/0082590；WO-A2 2004/022701；WO-A22009/012246；WO-A2 2004/067726中，所有均通過參考結合于此)。

然而，所有上述等溫擴增方法均需要復雜的反應方案，是相對慢的和/或僅限于相對短的模板序列。

發明內容

本發明提供了用于擴增核酸、優選雙鏈核酸的改進的方法，所述方法克服了現有技術的這些限制。本發明的方法基于改良的HDA方法。所提供的方法比常規的tHDA快，同時具有可靠的特異性。與類似于NEAR和EXPAR的方法相比，本發明的方法可以擴增更長的模板核酸。

本發明涉及在切口核酸內切酶存在下執行的HDA擴增方法。因此，在本發明的情形下，在解旋酶、合適的聚合酶、和切口核酸內切酶存在下擴增模板核酸。