[發明專利]基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法

有效

• 申請號: 201710104367.1
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106929563B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 張春陽;王黎娟;任明
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明公開了一種基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法，步驟如下：(1)將UDG作用底物加入到切除反應緩沖液中，進行切除修復反應，將UDG作用底物的尿嘧啶堿基切除，留下一個脫堿基位點；(2)將切除修復反應產物加入到擴增反應緩沖液中，進行酶輔助兩步串聯信號放大反應，即引發鏈置換反應和指數擴增反應，循環產生增強的熒光信號，通過熒光信號的強弱測定UDG的活性。本發明利用恒溫指數擴增反應的高擴增效率和核糖核酸酶H的特異性循環消化，實現了對尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性超高靈敏檢測。

技術領域

本發明涉及生物分析技術領域，特別是涉及一種基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法。

背景技術

基因組是由特異性配對的A:T/G:C堿基組成，其精確性和穩定性對生命體的維持具有十分重要的意義。但在現實生活中，基因組DNA堿基的結構經常遭受到來自于外部因素(如紫外線、電離輻射、有毒化學物質)和內源活性因素(如超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫等)的損害，造成DNA單、雙鏈斷裂，錯配，堿基缺失等，破壞基因組的完整性，導致基因組的不穩定、誘發癌變，從而影響物種的生存。為了降低體內基因組DNA的損傷，生物體內進化出多種損傷修復機制，僅針對單堿基突變就有錯配修復(MMR)，堿基切除修復(BER)，核苷酸切除修復(NER)等，其中堿基切除修復(BER)是修復堿基氧化損傷最重要方式。而啟動堿基切除修復(BER)最關鍵的一步是由DNA糖基化酶催化完成的。DNA糖基化酶是一類在堿基切除修復(BER)過程中負責損傷堿基識別和切除的起始酶，它的功能的異常會導致堿基切除修復機制無法運行，從而引發多種疾病，如人類免疫缺陷、神經退行性變、淋巴瘤、綻放綜合征以及乳腺癌等。

因此，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的超靈敏檢測對于基礎生物醫學的研究和人類各種疾病的早期臨床診斷有著十分重要的作用。到目前為止，已發展出多種方法用于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的檢測，其中凝膠電泳結合放射性標記被認為是檢測方法中的“黃金標準”。但是該方法具有一些無法克服的缺點，如放射性污染，檢測靈敏度低，以及消耗時間長等。近年來已研發出一些新的用于檢測尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的方法，如比色分析法，電化學分析法和以及熒光分析法。其中，比色分析法通過過氧化氫氧化2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS^2-)產生有色的ABTS^-，使尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的活性可視化，但是其檢測靈敏度無法與電化學方法和熒光方法相比。電化學分析方法在一定程度上提高了檢測靈敏度，但是需要將捕獲探針固定在固化載體上以及需要提前制備石墨烯電極，既耗時又費力。熒光方法設計簡單，操作方便，但無法避免檢測靈敏度低以及信號不穩定等缺點。綜上，盡管這些檢測尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的方法有效，但是仍然存在靈敏度偏低，損耗時間長，操作繁瑣等缺點。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法。本發明利用恒溫指數擴增反應的高擴增效率和核糖核酸酶H(RNase H)的特異性循環消化，實現了對尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性超高靈敏檢測。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法，步驟如下：

(1)將UDG作用底物加入到切除反應緩沖液中，進行切除修復反應，將UDG作用底物的尿嘧啶堿基切除，留下一個脫堿基位點；

(2)將切除修復反應產物加入到擴增反應緩沖液中，進行酶輔助兩步串聯信號放大反應，即引發鏈置換反應和指數擴增反應，循環產生增強的熒光信號，通過熒光信號的強弱測定UDG的活性。

步驟(1)中，所述UDG作用底物為發夾探針結構，所述發夾探針的莖部5′端有一個尿嘧啶(U)堿基，其與互補鏈上的腺嘌呤(A)互補配對；其環部上有一個切刻內切酶的識別位點。