[發明專利]基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法

有效

• 申請號: 201710104367.1
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106929563B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 張春陽;王黎娟;任明
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.一種用于非疾病診斷為目的的基于切除修復由酶介導的兩步串聯信號放大檢測UDG活性的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)將UDG作用底物加入到切除反應緩沖液中，進行切除修復反應，將UDG作用底物上的尿嘧啶堿基切除，留下一個脫堿基位點；

(2)將切除修復反應產物加入到擴增反應緩沖液中，進行酶輔助兩步串聯信號放大反應，即引發鏈置換反應和指數擴增反應，循環產生增強的熒光信號，通過熒光信號的強弱測定UDG的活性；

所述UDG作用底物為發夾探針結構，所述發夾探針的莖部5′端有一個尿嘧啶堿基，其與互補鏈上的腺嘌呤互補配對；其環部上有一個切刻內切酶的識別位點；

所述擴增反應緩沖液中，包含：BstDNA聚合酶、限制性核酸內切酶、指數擴增模板、信號探針、核糖核酸酶H、NEB緩沖液、ThermoPol緩沖液和核糖核酸酶H緩沖液；

所述切除反應緩沖液包含待檢測的尿嘧啶DNA糖基化酶、核酸內切酶IV和NEB緩沖液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，切除修復反應的條件為：37℃下孵育30-50分鐘。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，孵育時間為40分鐘。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，酶輔助兩步串聯信號放大反應的條件為：37℃下孵育60-80分鐘。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，孵育時間為70分鐘。

6.一種檢測UDG活性的試劑盒，其特征在于，包括：發夾探針、信號探針、指數擴增模板、BstDNA聚合酶、限制性核酸內切酶、核糖核酸酶H、NEB緩沖液、核酸內切酶IV、ThermoPol緩沖液和核糖核酸酶H緩沖液；所述發夾探針的莖部5′端有一個尿嘧啶堿基，其與互補鏈上的腺嘌呤互補配對；其環部上有一個切刻內切酶的識別位點；所述信號探針為兩端修飾有熒光分子和淬滅分子的RNA。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述發夾探針的序列如SEQ ID NO.1所示；所述信號探針的序列如SEQ ID NO.2所示；所述指數擴增的序列如SEQ ID NO.3所示。

8.權利要求6-7任一項所述的試劑盒在非疾病診斷為目的檢測UDG活性中的應用。