[發明專利]一種基于分級組裝的多個sgRNA串聯并行表達的克隆方法及應用

在審

• 申請號: 201710102894.9
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106868031A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 邵世鵬;常蕾;孫雨傲;孫育杰
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65;C12N15/85
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理事務所(普通合伙)11360
• 代理人: 張肖琪

The Hierarchical Assembly Method of Multiplexed sgRNA Expression and Its Applications

技術領域

本發明涉及一種分級組裝的多個sgRNA串聯并行表達的克隆方法及其在基因組編輯，基因表達調控和染色體標記方面的應用。屬于基因工程領域。

背景技術

哺乳細胞的細胞核是一個高度復雜的自組裝結構，染色質是其主要成分。染色質由DNA、RNA以及與其作用的蛋白組成，共同調控轉錄，DNA復制、修復和RNA剪接等細胞基礎生命活動。研究細胞中某些特定的過程由哪些基因控制，即表型與基因型之間的關系，需要能夠特異性的干擾某些基因的表達。這包括基因的永久性失活，基因表達的瞬時上調或者下調。同時很多研究表明染色體及基因的位置信息對基因表達調控有著重要意義，要研究清楚基因在細胞核內的空間位置與其功能的關系，需對細胞內特異的基因位點進行標記以獲得空間信息。同時還要獲得基因表達過程中的基因位置的動態信息，所以發展活細胞染色質DNA的熒光標記技術和方法對解決染色體結構和功能的關系非常重要。

近幾年發展的基于可編程的人工核酸酶可以滿足上述三種功能的需要。主要包括，ZFN(zinc finger nuclease，鋅指核酸酶)，TALE(transcriptional activator like effector，轉錄因子樣效應物)，CRISPR(cluster regularly interspace short palindromic repeat，成簇規則間隔的短回文重復)。ZFN和TALE依靠蛋白功能域實現特異性靶向，每個ZFN的功能域對應三個連續的核苷酸，而每個TALE的功能域對應一個核苷酸。要實現在哺乳動物細胞基因組的精確靶向，需要20個連續的核苷酸，因此需要將數十個蛋白功能域組合到一起。串聯重復序列的組裝是一個比較復雜繁瑣的過程。每當改變一個靶向序列需要重新設計一個新的蛋白，因此，ZFN和TALE通量低，無法實現大規模并行操作。而CRISPR系統的靶向特異性是由RNA的序列決定，依靠sgRNA(single guide RNA)和DNA的堿基互補配對實現正確靶向。每當轉換一個靶向位點，只需要設計一條新的sgRNA即可。因此CRISPR系統的通量可以非常高，甚至可以達到覆蓋整個基因組的水平。

使用CRISPR做基因敲除非常快捷有效，天然的Cas9蛋白具有RuvC和HNH兩個內切酶功能域，當提供正確的sgRNA靶向時，可以造成目標序列的雙鏈DNA斷裂，依賴于細胞的同源重組和非同源末端連接的修復機制，切斷的DNA可以進行再連接。依靠非同源末端連接修復途徑容易造成數個堿基的插入和缺失，因此可以造成編碼基因的讀碼框發生改變。當提供兩條sgRNA時，可以實現將這兩個sgRNA靶向位點之間的序列刪除，可以用于敲除非編碼序列。當給細胞提供與斷點兩端同源的模板時，依靠細胞同源重組的修復途徑，可以使目標序列發生替換，實現一段DNA序列的靶向插入。

利用CRISPR可以實現在不改變細胞的基因組的條件下干擾細胞內基因的表達。常見的上調基因表達的CRISPR激活系統(CRISPRa)和下調基因表達的CRISPR抑制系統(CRISPRi)。對野生型的Cas9做點突變，將之改造成只能結合DNA而不切割靶向序列的DNA結合蛋白dCas9。在dCas9上融合不同的蛋白，就可以實現不同的功能。如連接轉錄激活蛋白VP16，VP64，HSF1等就可實現對靶基因的定向激活。當連接轉錄抑制蛋白KRAB等就能實現對把序列的定向抑制。當連接組蛋白或者DNA修飾蛋白時，就可以定點改變基因組的表觀遺傳學狀態。

利用CRISPR也可以實現在不改變細胞的基因組的條件下對活細胞的染色質位點進行標記和追蹤。將dCas9融合熒光蛋白，利用sgRNA的靶向性，就可以實現在特定染色體位點富集熒光蛋白實現標記功能。利用一條靶向重復序列的sgRNA可以實現重復序列的標記，利用多條靶向不同非重復序列的sgRNA可以實現非重復序列的標記。