[發明專利]一種基于分級組裝的多個sgRNA串聯并行表達的克隆方法及應用

在審

• 申請號: 201710102894.9
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106868031A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 邵世鵬;常蕾;孫雨傲;孫育杰
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65;C12N15/85
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理事務所(普通合伙)11360
• 代理人: 張肖琪

1.一種基于分級組裝的多個sgRNA串聯并行表達的克隆方法，其特征在于，利用GoldenGate克隆反應，將多達幾十個不同的sgRNA同時串聯到同一個表達載體上，從而實現并行表達。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，可以使用不依賴載體的基于聚合酶鏈式反應(PCR)的多輪擴增。

3.根據權利要求1和2所述的方法，一種基于分級組裝的多個sgRNA串聯并行表達的不依賴于載體的克隆方法，其特征在于，由以下步驟制備：

先通過PCR擴增出表達小RNA的啟動子和sgRNA基礎骨架，將合成的靶向配對引物兩條鏈退火，通過第一步Golden Gate反應將啟動子，靶向序列，sgRNA骨架連接起來。再通過對反應混合液的直接PCR擴增，使用接頭互補的，帶有Type IIs限制性酶切位點的引物，獲得大量的帶有接頭的連接產物。然后將上步所得產物分組混合，繼續進行第二步GoldenGate反應進行連接，對反應混合液再次使用接頭互補的，帶有Type IIs限制性酶切位點的引物擴增，最后將擴增好的多個片段混合，通過第三步Golden Gate反應連入最終的目的載體。目的載體帶有紅色熒光蛋白的表達框，用于指示多sgRNA并行表達載體的轉染情況。不依賴于載體的多個sgRNA串聯并行表達的克隆方法中多個步驟所使用的Type IIs限制性內切酶可以是同一種酶，也可以是不同種酶。

4.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于，每一個sgRNA都有自己的表達框，含有獨立的啟動子和終止子，互相之間無相互干擾。

5.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA串聯數量可根據需要調整。

6.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的分級擴增可以為一輪，兩輪，或者多輪，可根據所要串聯的sgRNA需要進行調整。

7.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于，利用Type IIs的限制內切酶和連接酶將多個sgRNA連接進同一個載體。

8.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述的多級sgRNA串聯表達方法可以針對不同來源的CRISPR系統，包括但不局限于SP、NM、ST1、SA、CPF1、C2C2等。

9.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述的多級sgRNA串聯表達方法可以針對最原始的sgRNA，也可以針對插入功能拓展域的修飾的sgRNA，所插入的RNA適配子是MS2或者PP7或者Spinach或者COM或者λN等。

10.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述的多級sgRNA串聯表達方法可以利用不同的啟動子，包括但不局限于U6、H1、7SK等驅動小RNA表達的啟動子。

11.權利要求1所述的方法在基因組靶向編輯中的應用。

12.權利要求1所述的方法在基因定點表達調控中的應用。

13.權利要求1所述的方法在染色質位點標記中的應用。

14.如權利要求11所述的應用，其特征在于利用同一個質粒上同時表達的多條sgRNA,可以靶向不同的染色質區域，利用Cas9造成DNA雙鏈斷裂，利用細胞自身的非同源末端連接的修復機制進行易錯修復，以達到對多個靶基因或其他非基因的功能性片段同時敲除的目的。

15.如權利要求11所述的應用，其特征在于利用同一個質粒上同時表達的多條sgRNA,可以靶向染色質同一區域，利用Cas9在同一個基因位點造成多處DNA雙鏈斷裂，防止細胞自身的非同源末端連接的修復機制造成斷點原樣再連接，以達到對同一個基因的高效率敲除的目的。

16.如權利要求11所述的應用，其特征在于利用同一個質粒上同時表達的多條sgRNA,可以靶向不同的染色質區域，利用Cas9造成DNA雙鏈斷裂，在共轉染同源修復模板的協助下，利用細胞自身的同源重組的修復機制進行精準修復，以達到對多個靶基因或其他非基因的功能性片段同時任意修改的目的。