[發明專利]一種高保真快速擴增融合酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201710102864.8
• 申請日: 2017-02-24
• 公開（公告）號: CN106754816B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 荀恒杰;陳旭;陳剛
• 申請（專利權）人: 依科賽生物科技(太倉)有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/62;C12N15/63
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 馬廣旭

本發明提供了一種高保真快速擴增融合酶以及該高保真快速擴增融合酶的制備方法。其中本發明所述的高保真快速擴增融合酶包括在高溫條件下能夠與模板和引物結合的非特異性雙鏈結合區的氨基酸序列，以及經過多步生物技術方法改造后的嗜熱古細菌DNA聚合酶的氨基酸序列。本發明所述的高保真快速擴增融合酶，保真度高，擴增速度快，在高溫條件下活性好，并且可以特別用于超長序列擴增和測序，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于生物技術的應用領域，涉及到一種高保真快速擴增融合酶以及其制備方法，特別但不限于應用于超長序列擴增和測序。

背景技術

DNA聚合酶是基因工程領域常見的一大類工具酶，被廣泛應用于分子克隆、探針標記、鏈或引物延伸、補平或抹平以及核苷酸測序等許多領域。它有4大類型，其中A型和B型占多，A型和B型DNA聚合酶一部分為常用的常溫DNA聚合酶，對微量底物模板的擴增效率不高，影響了其使用范圍；一部分為常用的耐高溫DNA聚合酶，它們對微量底物模板的擴增效率非常高，可以通過PCR將底物模板在很短的時間內將模板量增加幾百到幾千萬倍，因而在生物醫學領域有較廣泛的應用。比較常見的DNA聚合酶為Taq DNA Polymerase、Pfu DNAPolymerase、Kod DNA Polymerase、Vent DNA Polymerase、 Deep Vent DNA Polymerase等。

根據相關文獻記載，Taq DNA Polymerase無3^，-5^，外切酶活性，在PCR循環中，產生的錯誤堿基的滲入率較高，突變率為2x10^-5/堿基/循環，DNA聚合時的延伸速度為1kb左右/min，95℃時半衰期40分鐘左右；Pfu DNA Polymerase有3^，-5^，外切酶活性，在PCR循環中，產生的錯誤堿基的滲入率中等，突變2.5x10^-6/堿基/循環，DNA聚合時的延伸速度為0.6kb左右/min，95℃溫浴1小時仍然有90%以上的酶保持活性；Kod DNA Polymerase有3^，-5^，外切酶活性，在PCR循環中，產生的錯誤堿基的滲入率中等，突變率為2.0x10^-6/堿基/循環，DNA聚合時的延伸速度為2kb左右/min，100℃溫浴1小時仍然有70%以上的酶保持活性；Vent DNAPolymerase有3^，-5^，外切酶活性，在PCR循環中，產生的錯誤堿基的滲入率中等，突變率為4x10^-6/堿基/循環，DNA聚合時的延伸速度為1kb左右/min，95℃溫浴1小時仍然有90%以上的酶保持活性；Deep Vent DNA Polymerase有3^，-5^，外切酶活性，它的錯誤堿基的滲入突變率和延伸速度與Vent DNA Polymerase相似，但是耐熱性更高，95℃時半衰期長達8小時左右。

以上的幾種用于PCR擴增的DNA聚合酶，在突變率，耐熱性和延伸速度，要么有缺點，要么整體上這幾個方面的性能并不十分突出，而這三個方面是該酶是否適用于超長序列擴增和測序，快速獲得最佳效果和準確數據的關鍵指標。

發明內容

發明目的：為了克服以上不足，本發明的目的在于優化設計并表達純化出具有較低突變率和較高延伸速度的高性能PCR反應及測序用融合酶，以及其制備方法，并進一步提供了該高保真快速擴增融合酶的氨基酸和基因編碼信息，特別應用于超長序列擴增和測序。