[發明專利]一種檢測糞便中具核梭桿菌的核酸組合及其應用與試劑盒

在審

• 申請號: 201710101308.9
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106591488A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 張良祿;董蘭蘭;姚希輝
• 申請（專利權）人: 武漢艾米森生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371
• 代理人: 李進

技術領域

本發明涉及生物醫學檢驗技術領域，且特別涉及一種檢測糞便中具核梭桿菌的核酸組合及其應用與試劑盒。

背景技術

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)為常見多發的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率均位于全世界常見惡性腫瘤的第3位。在中國，近年結直腸癌發病率逐年上升，估計每年約有40萬新發病例，目前在我國消化系統惡性腫瘤中位列第2位。早期結直腸癌患者手術5年生存率可高達90％以上，而中、晚期患者5年生存率僅10％左右，臨床診斷的結腸癌約80％為中晚期，這是導致其死亡率無明顯改善的關鍵因素之一。而有效的早期直結腸癌患者可使直結腸癌發病率降低60％，病死率降低80％，因此結直腸癌的早期發現、早期診斷及早期治療顯得尤為重要。

目前，直結腸癌非侵入式檢測方法用于疾病的篩查有效力非常低下，因為需要患者每年收集糞便樣本便潛血試驗或糞便免疫化學熒光檢測，假陽性比率高，結果穩定性差，總體受檢率小于3％。盡管乙狀結腸鏡檢查或結腸鏡檢查檢出率較高，是直結腸癌檢查的金標準，但是需要患者做清理腸道準備、依靠麻醉并且侵犯隱私，患者會產生恐懼心理，檢查出血或者感染等情況，總體依從性較差，受檢率小于5％。因此，高特異性、高靈敏度、依從性好、非侵入式的直結腸癌早期診斷技術亟待解決。

具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)是常見的革蘭氏陰性無芽胞厭氧桿菌，以口腔牙垢中最為多見。2011年10月兩支獨立的研究團隊證實具核梭桿菌也存在于腸道中，并且具核梭桿菌的豐度與結直腸癌有關。2013年哈佛醫學院與凱斯西儲大學證實具核梭桿菌通過誘導炎性反應、促癌信號通路開放，促進結直腸癌增殖。

目前，對具核梭桿菌的應用主要集中在口腔類疾病以及常見癌癥方面；也不能進行定量檢測，糞便中具核梭桿菌及其具體檢測方法也未見報道。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種檢測糞便中具核梭桿菌的核酸組合，該核酸組合能特異的、高靈敏度檢測具核梭桿菌。

本發明的第二目的在于提供上述核酸組合在檢測糞便中具核梭桿菌的應用。

本發明的第三目的在于提供上述核酸組合在制備檢測癌癥的試劑盒中的應用。

本發明的第四目的在于提供上述核酸組合在制備檢測具核梭桿菌的試劑盒中的應用。

本發明的第五目的在于提供一種檢測糞便具核梭桿菌的試劑盒，該試劑盒能方便快速應用于檢測糞便中具核梭桿菌，方便操作，利于推廣應用。

本發明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。

本發明提供一種檢測糞便中具核梭桿菌的核酸組合，核酸組合包括引物組合和探針；引物組合包括第一引物對、第二引物對和第三引物對，第一引物對的堿基序列如SEQ ID NO.1-2所示，第二引物對的堿基序列如SEQ ID NO.3-4所示，第三引物對的堿基序列如SEQ IDNO.5-6所示；探針包括第一探針、第二探針和第三探針，第一探針的堿基序列如SEQ ID NO.7所示，第二探針的序列如SEQ ID NO.8所示，第三探針的序列如SEQ ID NO.9所示；探針的5'端標記有熒光基團，探針3'端標記有淬滅基團，熒光基團為FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一種，所述淬滅基團為6-TAMRA、BHQ-1～3、和結合分子溝的非熒光淬滅劑中的一種。

進一步，上述第一引物對為具核梭桿菌檢測引物，上游檢測引物包括SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列為5’-TCTCCTTTCAATAAA AGTGGC-3’；

具核梭桿菌下游檢測引物包括SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列為：5’-AAGAAGTAGGATGAAAATCAGTTA-3’；

進一步具核梭桿菌探針包括SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列，SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列為5’-AGACCGATGCTCTACC-3’；

進一步，檢測探針的5'端標記有熒光基團，檢測探針的3'端標記有淬滅基團。