[發明專利]用于檢測蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710100714.3
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106755598A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 薄清如;羅寶正;趙福振;陳軒;廖秀云;成曉維;徐海聶;陳敬
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙)11491
• 代理人: 姜彥

技術領域

本發明屬于蝦黃頭病病毒檢測技術領域，尤其涉及一種用于檢測蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物及其檢測方法。

背景技術

黃頭病(Yellow Head Disease，YHD)是由黃頭病毒(Yellow Head Virus，YHV)引起的對蝦傳染性疾病，黃頭病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)桿套病毒科(Roniviridae)頭甲病毒屬(Okavirus)的單鏈RNA病毒，因瀕死蝦頭胸部因肝胰腺發黃而變成黃色，被稱為黃頭病。黃頭病毒傳染率很高，且從對蝦感染到死亡經歷的時間只有幾天時間，給水產養殖人員帶來了巨大的經濟損失。1992年，泰國因對蝦感染了黃頭病毒導致減產五千噸，經濟損失重大。該病在感染初期的2～4天時會出現不正常的大量進食的現象,而后幾乎完全停止進食,接下來便會發現有大量垂死的蝦只會聚集在養殖池的池水表面或池塘周圍，在嚴重發病時可使全池的蝦在3天內基本全部死亡，死亡率很高。我國將其列為二類疫病，世界動物衛生組織(Office International des Epizooties，OIE)將其列為必須申報的疫病。已知的黃頭病毒群有六種，分為YHV(YHV-1型)、鰓聯病毒(Gill-associated virus，GAV)(YHV-2型)及其它4種基因型(YHV-3型–YHV-6型)。其中YHV-3型–YHV-6型常見于東非、亞洲和澳大利亞的健康的斑節對蝦，表現為極少或從不引發疾病。YHV可以在海水中存活三天以上，在60℃下15分鐘可以將其滅活。至今為止，國內外對于YHV的檢測方法目前并不多，其中分子學檢測方法主要為液相基因芯片法和RT-PCR法，OIE《水生動物診斷手冊》(OIE，2012)推薦的為RT-PCR法，但需要后續的處理過程，步驟繁瑣，耗時也較長，工作量較大。而實時熒光RT-PCR技術的發展，使病毒檢測技術得到了進一步提高，這種檢測技術也被應用到IHNV、VHSV和SVCV的檢測中。實時熒光RT-PCR技術進一步提高了檢測的特異性、靈敏度，減少了工作量，提高了工作效率，而且還可以對目的片段進行定量檢測，但TaqMan熒光RT-PCR由于使用的熒光探針，其成本較普通PCR高。

綜上所述，現有的蝦黃頭病病毒的檢測方法存在步驟繁瑣，耗時也較長，工作量較大，成本較高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物及其檢測方法，旨在解決現有的蝦黃頭病病毒的檢測方法存在步驟繁瑣，耗時也較長，工作量較大，成本較高的問題。

本發明是這樣實現的，一種用于檢測蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物，所述用于檢測蝦黃頭病病毒的熒光引物的序列為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

本發明的另一目的在于提供一種所述的用于檢測蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物的設計方法，所述設計方法包括以下步驟：

按照LAMP引物設計原則，根據GenBank數據庫中下載YHV基因組序列，進行多序列比對，尋找YHV的一段保守基因作為擴增對象，然后通過分子生物學軟件LAMP Designer1.1.4設計引物；采用HPLC純化方式；合成后的引物用DEPC水稀釋成100μmol/L溶液，-20℃保存備用。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述用于檢測蝦黃頭病毒熒光LAMP引物的用于檢測蝦黃頭病毒的檢測方法，所述用于檢測蝦黃頭病毒的檢測方法包括以下步驟：

步驟一，樣品的核酸提取：按照核酸提取試劑盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit(200)說明書提取樣品核酸；

步驟二，反應管中成分配制：LAMP反應體系總體積為25μL，其中2×Taq反應液RM 12.5μL，內引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，環引物LF和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆轉錄酶0.2μL，熒光染料0.5μL，RNA模版2.0μL，補水至25.0μL。最后加20.0μL的封閉液以避免體系揮發和產物污染；

步驟三，儀器檢測：對反應置于60℃至65℃的反應環境中并以1℃遞增進行優化，從多次重復試驗中確定最佳反應溫度；在熒光PCR儀上反應條件調整為保溫階段63℃1min，1個循環；循環階段63℃15s，63℃45s，60個循環；于63℃45s處收集熒光信號，熒光通道選為FAM。