[發(fā)明專利]用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710100714.3
• 申請(qǐng)日: 2017-02-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106755598A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薄清如;羅寶正;趙福振;陳軒;廖秀云;成曉維;徐海聶;陳敬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京國(guó)坤專利代理事務(wù)所(普通合伙)11491
• 代理人: 姜彥

1.一種用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物，其特征在于，所述用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的熒光引物的序列為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

2.一種如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的熒光LAMP引物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步驟：

按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中YHV的YHV-1型—YHV-6型的基因組序列，經(jīng)多序列比對(duì)，以O(shè)RF1基因作為擴(kuò)增對(duì)象，然后通過(guò)分子生物學(xué)軟件LAMP Dsigner1.1.4設(shè)計(jì)引物；采用HPLC純化方式；合成后的引物用超純水稀釋成100μmol/L溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.一種利用權(quán)利要求1所述用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的檢測(cè)方法包括：

步驟一，樣品的核酸提取：按照核酸提取試劑盒Mag-BindViral DNA/RNA Kit200說(shuō)明書(shū)提取樣品核酸；

步驟二，反應(yīng)管中成分配制：LAMP反應(yīng)體系總體積為25μL，其中2×Taq反應(yīng)液RM 12.5μL，內(nèi)引物FIP、BIP40μmol/L各1.0μL，環(huán)引物L(fēng)F和LB各1.0μL，外引物F3、B35μmol/L各1.0μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.2μL，熒光染料0.5μL，病毒核酸模板2.0μL，補(bǔ)水至25.0μL；最后加20.0μL的封閉液以避免體系揮發(fā)和產(chǎn)物污染；

步驟三，儀器檢測(cè)：對(duì)反應(yīng)置于60℃至65℃的反應(yīng)環(huán)境中并以1℃遞增進(jìn)行優(yōu)化，從多次重復(fù)試驗(yàn)中確定最佳反應(yīng)溫度；在熒光PCR儀上反應(yīng)條件調(diào)整為保溫階段63℃1min，1個(gè)循環(huán)；循環(huán)階段63℃15s，63℃45s，60個(gè)循環(huán)；于63℃45s處收集熒光信號(hào)，熒光通道選為FAM。

4.如權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)蝦黃頭病病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)反應(yīng)置于60℃至65℃的反應(yīng)環(huán)境中并以1℃遞增進(jìn)行優(yōu)化，從多次重復(fù)試驗(yàn)中確定最佳反應(yīng)溫度；在熒光PCR儀上反應(yīng)條件調(diào)整為保溫階段63℃1min；循環(huán)階段63℃15s，63℃45s，60個(gè)循環(huán)；于63℃45s處收集熒光信號(hào)，熒光通道選為FAM。