[發明專利]犬卵母細胞的體外成熟方法

有效

• 申請號: 201710099954.6
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107043743B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 馮沖;鄭敏
• 申請（專利權）人: 北京希諾谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;王朋飛

本發明涉及犬卵母細胞的體外成熟(IVM)方法，尤其是涉及三階段培養犬卵母細胞的體外成熟方法。

技術領域

本發明涉及犬卵母細胞的體外成熟(IVM)方法，尤其是涉及三階段培養犬卵母細胞的體外成熟方法。

背景技術

犬繁殖生理與通常的其他哺乳動物有很大區別。犬是非季節單次發情動物，一年僅排卵1-2次，間隔為4-12個月。犬的繁殖周期具有較長的動情前期和發情期的特征(大約一周)，黃體期在循環的孕酮作用下平均持續2個月。至發情后期，黃體功能逐漸退化，使犬進入2-10個月的長時間乏情階段。乏情時缺乏性行為或性腺活動，而且孕酮濃度到達最低點。從乏情中期到末期，下丘腦分泌促性腺釋放激素(GnRH)增多，從而刺激促卵泡素(FSH)分泌量增加和促黃體素(LH)的釋放。

FSH在開始發情前期對卵泡發生發揮重要作用，對于發情后期，LH峰促使成熟卵泡快速發育和排卵前黃體化，犬在LH峰40-50小時后排卵。發情行為和排卵是在雌激素循環下降和孕激素顯著上升的作用下完成的。排卵前卵泡已經黃體化，此時大多數哺乳動物排出的卵母細胞已經成熟，處于第二次減數分裂中期(MII期)，而犬的卵母細胞第一次減數分裂才開始。由于犬排卵后的卵母細胞大部分處于GV(生發泡)期，尚未成熟，增加了其在輸卵管中與精子受精的可能性，因此未成熟的卵母細胞也能受精，也能形成原核。犬科動物與它哺乳動物相比這些特殊的生殖生理特點，對于進行犬卵母細胞的體外成熟造成了相當大的難度。

國內外在犬科動物卵母細胞成熟方面均處于條件摸索階段。1976年Mahi、Yanagimacbi首次報道了犬科動物卵母細胞的體外成熟培養，由此開始，研究人員開始對體外培養狐、犬卵母細胞進行了各種各樣的嘗試，例如采用TCM-199、SOF等常用的基礎培養液進行培養。激素作為對卵母細胞成熟重要的影響因素，研究者進行了各種激素及激素組合的嘗試，但到目前為止還沒有找到合適的激素組合來提高卵母細胞的成熟率。為了提高犬卵母細胞體外達到MII期(第二次減數分裂中期)的成熟率，研究者開始嘗試其它的培養方式。Hewitt(2001)首先關注輸卵管環境對卵母細胞成熟的影響，用發情犬的輸卵管組織與輸卵管液進行與卵母細胞共培養，結果表明在共培養后減數分裂恢復率顯著提高(EnglandG CW,Vemtegen JP,Hewitt DA.Pregnancy following in vitro fertilization ofcanine oocytesIJ].Vet Rec,2001,148:20-229)。Shimazu等(1993)研究證明，發情犬的輸卵管上皮細胞共培養，培養48h、72h卵母細胞的成熟率能有明顯的提高(48h MII期達16.7％，72h MII期達23.2％)(Yamadas,Shimazu Y,Kawano Y,et al.In vitromaturation and fertilization of dog ooeytes[J].Reprod Fertil,1993,47(SuPPI):227-235)。

研究人員雖然還在供體年齡、品種、繁殖周期、卵巢卵泡大小、培養基、體外成熟時間、添加蛋白、激素及共培養等方面對犬科動物卵母細胞體外成熟進行了研究，但是現有技術往往都是采用單一的培養方法或者單一的培養基，在成熟的不同階段更換新鮮培養基，在單一的培養基中添加2-3種激素。雖然也有少數報道犬科動物卵母細胞的成熟分兩個階段進行，但是總的來說這樣的成熟方案與其他哺乳動物采用的卵母細胞的體外成熟方法并無太大差別。然而，犬的卵母細胞在體內成熟過程是分階段進行的，且主要以排卵后為成熟的重要階段。因此采用單一培養基或激素配比無法模擬犬卵母細胞體內成熟的過程，無法滿足犬卵母細胞體外成熟的要求，造成犬卵母細胞體外成熟率較低且質量較差，目前所有犬卵母細胞的體外成熟方案的成熟率僅為10-20％左右。

因此，非常需要開發有效提高犬卵母細胞體外成熟率的方法，也就是提高犬卵母細胞體外達到MII期(第二次減數分裂中期)成熟率的方法，從而建立犬卵母細胞的體外成熟體系，使犬成熟卵母細胞的來源更為廣泛，代替原有通過手術法沖取成熟卵母細胞的方案。

發明內容