[發明專利]犬卵母細胞的體外成熟方法

有效

• 申請號: 201710099954.6
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107043743B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 馮沖;鄭敏
• 申請（專利權）人: 北京希諾谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;王朋飛

1.犬卵母細胞的三階段體外成熟方法，其特征在于所述方法包括如下步驟：(1)以NCSU-23作為基礎培養基，添加10％發情母犬血清、10ng/mL的EGF、2IU/mL的FSH、2IU/mL的LH及2IU/mL的E2，每12小時換液1次，培養包裹三層以上卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體24小時，作為第一階段；(2)采用NCSU-23培養基，添加0.8％的BSA、10ng/mL的EGF、10IU/mL的PMSG、10IU/mL的HCG及2IU/mL的E2，對步驟(1)獲得的培養細胞繼續培養24小時，作為第二階段；以及(3)采用離子霉素及6-DMAP對卵母細胞進行化學激活，激活后，在底部培養有輸卵管上皮細胞的培養皿中，采用添加0.8％BSA及10ng/mL EGF的mSOF培養基進行體外成熟24小時，作為第三階段。

2.根據權利要求1的犬卵母細胞的三階段體外成熟方法，其特征在于所述底部培養有輸卵管上皮細胞的培養皿的制備方法為：在超凈臺中將輸卵管從離體獲得的卵巢囊表面分離，然后將輸卵管的一段結扎，用1mL注射器將0.1％的I型膠原酶注入輸卵管內，然后將輸卵管的另一端結扎，放入培養箱中消化0.5-2h，然后用含有10％胎牛血清的內皮培養基ECM終止消化，離心去除上清液后，放入35mm培養皿進行培養，每48小時換液一次，細胞生長至90％匯合時凍存。

3.根據權利要求1或2的犬卵母細胞的三階段體外成熟方法，其特征在于所述mSOF培養基每100mL的配方如下：NaCl，0.626g；KCl，0.05364g；MgCl₂·6H₂O，0.01017g；KH₂PO₄，0.01632g；60％乳酸鈉，12.5μL；葡萄糖，0.027g；CaCl₂·2H₂O，0.025g；NaHCO₃，0.2100g；丙酮酸鈉，0.0033g；谷氨酰胺，0.014615g；必需氨基酸，2％；非必需氨基酸，1％；酚紅，100ml+100μl；牛血清白蛋白，0.8g；

所述NCSU-23培養基每100mL的配方如下：NaCl，0.6356g；KCl，0.0356g；MgSO₄·7H₂O，0.0294g；KH₂PO₄，0.0162g；CaCl₂·2H₂O，0.025g；葡萄糖，0.1g；谷氨酰胺，0.0146g；?；撬?，0.0876g；亞牛磺酸，0.0546g；鏈霉素，0.005g；青霉素，0.0066g；非必需氨基酸，1％；酚紅，100μL。