[發明專利]汞離子食品污染中直接競爭酶聯免疫檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710099835.0
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106872692B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 王秋霞;馬景周;歐長波;張艷紅;魏小兵;余燕;劉興友;姜金慶;秦保亮
• 申請（專利權）人: 河南科技學院;方城縣機電信息中等職業學校
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

1.一種基于直接競爭酶聯免疫法汞離子檢測試劑盒，包括：

(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板，所述檢測板真空密封包裝；所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為80～150μg/mL；

(2)質量濃度為30～40μg/mL的酶標Hg-ITCBE鰲合物半抗原溶液；

(3)質量濃度為13～18μg/mL的抗汞離子單克隆抗體溶液；所述抗汞離子單克隆抗體溶液由Hg-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來；

(4)1.0～3.0mol/L的終止液；

(5)樣品稀釋液；

(6)底物顯色液；

(7)洗滌液；

(8)汞離子標準品溶液；

(9)質量濃度為10～20mg/mL的EDTA處理液；

所述樣品稀釋液為質量濃度為2～10g/L的HEPES緩沖液；

所述洗滌液為包含質量濃度0.05～0.1％Tween 20的PBS溶液；

所述Hg-ITCBE-cBSA免疫原的制備方法包括以下步驟：

(1)將ITCBE和二甲基亞砜按照ITCBE的質量和二甲基亞砜的體積比為(8～12)mg∶1mL混合，形成金屬鰲合劑溶液；

(2)將硝酸汞Hg(NO₃)₂與HEPES緩沖液按照11.25mg∶1mL的比例混合，形成Hg²⁺溶液；

(3)將所述步驟(1)中得到的金屬鰲合劑溶液和所述步驟(2)中得到的Hg²⁺溶液按照體積比為1∶1混合，調節混合液pH值至7.0，然后在23～27℃條件下振蕩反應10～14h，形成Hg-ITCBE鰲合物半抗原；

(4)將BSA、EDC與PBS緩沖液混合攪拌得到混合液，BSA質量、EDC質量與PBS緩沖液的體積比為66mg∶11.6mg∶5mL，將所述混合液與乙二胺按照混合液體積和乙二胺質量比為5mL∶7mg的比例混合，37℃振蕩反應2h得反應液；反應液用PBS透析4d，得到活化的載體蛋白BSA；

(5)將所述活化的載體蛋白BSA和pH值為8.0的HEPES緩沖液混合，形成濃度為30mg/mL的載體蛋白溶液；

(6)將所述步驟(3)中得到的Hg-ITCBE鰲合物半抗原溶液和所述步驟(5)得到的載體蛋白溶液按照體積比為1∶1的比例混合，調節pH值至9.0，23～27℃條件下振蕩反應22～26h，將得到的反應液裝入透析袋，先用蒸餾水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Hg-ITCBE-cBSA免疫原；

所述酶標Hg-ITCBE鰲合物半抗原的制備方法，包括以下步驟：

A.將ITCBE與二甲基亞砜混合形成金屬鰲合劑溶液；

B.將硝酸汞Hg(NO₃)₂與HEPES緩沖液混合，形成Hg²⁺溶液；

C.將所述步驟A中得到的金屬鰲合劑溶液和所述步驟B中得到的Hg²⁺溶液混合，調節混合液的pH值至7.0～7.2，得到的混合液振蕩反應10～14h，形成Hg-ITCBE鰲合物半抗原；

D.將標記用酶與HEPES緩沖液混合，得到酶溶液；

E.將所述步驟C得到的Hg-ITCBE鰲合物半抗原溶液與所述步驟D中得到的酶溶液混合，調節混合物的pH值至8.8～9.2，再將混合液振蕩反應22～26h，得到酶標Hg-ITCBE螯合物半抗原；

所述步驟A與B之間沒有時間順序的限制；C和D之間，D與A和B之間同樣沒有時間順序的限制。

2.權利要求1所述汞離子檢測試劑盒在檢測環境中汞離子的應用，其特征在于，包括以下步驟：

a、將抗汞離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Hg-ITCBE鰲合物半抗原溶液加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板孔內，混合，孵育后用洗滌液洗滌；

b、向檢測板中加入底物顯色液，孵育，加入終止液混合，測定OD值；

c、根據所述步驟b得到的OD值與預定的標準曲線，得到待測樣品中汞離子的濃度，所述標準曲線是汞離子濃度與OD值之間的線性關系曲線。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測板孔內抗汞離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Hg-ITCBE鰲合物半抗原溶液的體積比為1～2∶1～2∶1～2。