[發(fā)明專利]利用數(shù)字PCR檢測馬鈴薯X病毒的方法及其專用成套試劑

在審

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• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106868209A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張永江;相寧;黃潔芳;王晨光;付偉;朱鵬宇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,何葉喧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用數(shù)字PCR檢測馬鈴薯X病毒的方法及其專用成套試劑。

背景技術(shù)

馬鈴薯是世界上種植和食用國家最多的作物，也是在全球經(jīng)濟中繼水稻、小麥和玉米之后的第4大糧食作物。馬鈴薯是全世界的高產(chǎn)作物之一，中國種植馬鈴薯面積居全世界第一位。近年來，我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，馬鈴薯在我國國民經(jīng)濟增長中占有重要比重，但我國現(xiàn)階段馬鈴薯整體生產(chǎn)水平低于世界平均水平，其主要原因便是受馬鈴薯病毒的影響。馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)是馬鈴薯病毒之一，其分布廣泛，在世界各馬鈴薯種植區(qū)均有發(fā)生。PVX是甲型線形病毒科(Alphaflexiviridae)、馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)的典型成員，是由一條正鏈RNA組成的線性病毒，長度約為6.4kb，其RNA的3′末端是多聚腺嘌呤核苷酸，5′末端有m7GppG“帽子”結(jié)構(gòu)。PVX的病毒粒子為長桿狀，約515nm×13nm，自然條件下主要靠植株不同部位之間及植株間相互接觸摩擦進行機械傳播。PVX通常引起花葉癥狀，某些馬鈴薯品種感染輕微或潛伏起來，有的株系可能引起皺縮；某些馬鈴薯品種對特定的病毒株系過敏，反應(yīng)為頂部壞死。據(jù)報道，PVX單獨侵染馬鈴薯可降低產(chǎn)量15％左右。在田間，PVX也可與其它病毒混合侵染，其造成的危害更為嚴重，導(dǎo)致馬鈴薯的毀滅性減產(chǎn)。

目前尚無有效的藥劑可以防治PVX，因此，加強對PVX的快速精準檢測是一個亟待解決的課題。同時脫除病毒和建立無病毒馬鈴薯快繁體系已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的有效保證，在脫毒馬鈴薯快繁體系中建立快速、有效的檢測方法是重要的環(huán)節(jié)。目前，檢測PVX的技術(shù)主要有傳統(tǒng)生物學(xué)檢測技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)等。傳統(tǒng)生物學(xué)檢測技術(shù)盡管檢測的結(jié)果相當(dāng)直觀可靠，但是還是具有一些明顯的不足，如靈敏度不高，工作量大，難以檢測大量的樣品。免疫學(xué)檢測技術(shù)中常用的DAS-ELISA病毒病檢測方法是利用血清學(xué)原理建立的，雖具有簡單、快速的特點，非常適合應(yīng)用在田間檢測，但檢測的結(jié)果存在著假陽性或假陰性現(xiàn)象，而且只是檢測了病毒的外殼蛋白(CP)，其遺傳信息量只占整個病毒遺傳信息量的5％～10％，無法區(qū)分因CP基因有一定同源性的病毒類型，且存在不易檢測含量極少的韌皮部病毒和不能檢測休眠種薯中的病毒等方面的缺陷。分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如RT-PCR技術(shù)，相對于血清檢測法不用制備抗體，而且省時又省力，已經(jīng)用于PVX的檢測，但對病毒濃度低的樣品(如韌皮部樣品和休眠未出芽或自然老的塊莖)卻不足以做出可靠的診斷。

數(shù)字PCR(Digital-PCR)是一種新型的PCR檢測方法，其基本原理是通過將微量樣品進行大倍數(shù)稀釋和分液，直至每個樣品中所含有的待測分子數(shù)不超過1個，再將所有樣品在相同條件下進行PCR擴增，有PCR擴增熒光信號記為1，無熒光信號記為0，有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標分子，針對反應(yīng)結(jié)果采用泊松分布(Poisson distribution)公式，便可計算出樣本的最初拷貝數(shù)或濃度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測馬鈴薯X病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種檢測馬鈴薯X病毒的成套試劑。

本發(fā)明所提供的檢測馬鈴薯X病毒的成套試劑，可由引物對X1和探針PVX-p組成；所述引物對X1可由引物PVX-f和引物PVX-r組成；所述引物對X1的靶序列含有特異DNA片段；所述特異DNA片段可為如下y1)或y2)：

y1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

y2)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述探針PVX-p可為20-30個核苷酸組成的單鏈DNA分子，與所述特異DNA片段中的部分區(qū)段相同。

上述成套試劑中，所述引物PVX-f可為如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的單鏈DNA分子；

a2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的單鏈DNA分子。

上述成套試劑中，所述引物PVX-r可為如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列2所示的單鏈DNA分子；

b2)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的單鏈DNA分子。

上述成套試劑中，所述探針PVX-p可為如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列3所示的單鏈DNA分子；