[發明專利]鉛離子環境污染中直接競爭酶聯免疫檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710099363.9
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106872708B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 姜金慶;劉長忠;張慧輝;王自良;楊雪峰;李廣領;齊永華;范國英;張海棠;李藝
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

1.一種基于直接競爭酶聯免疫法鉛離子檢測試劑盒，包括：

(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板，所述檢測板真空密封包裝；所述羊抗鼠IgG二抗的包被濃度為80～150μg/mL；

(2)質量濃度為30～40μg/mL的酶標Pb-ITCBE鰲合物半抗原溶液；

(3)質量濃度為13～18μg/mL的抗鉛離子單克隆抗體溶液；所述抗鉛離子單克隆抗體溶液由Pb-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制備而來；

(4)1.0～3.0mol/L的終止液；

(5)樣品稀釋液；

(6)底物顯色液；

(7)洗滌液；

(8)鉛離子標準品溶液；

(9)質量濃度為10～20mg/mL的EDTA處理液；

所述樣品稀釋液為質量濃度為2～10g/L的HEPES緩沖液；

所述洗滌液為包含質量濃度0.05～0.1％Tween 20的PBS溶液；

所述Pb-ITCBE-cBSA免疫原的制備方法包括以下步驟：

(1)將ITCBE和二甲基亞砜(DMSO)按照ITCBE的質量和二甲基亞砜的體積比為(8～12)mg∶1mL混合，形成金屬鰲合劑溶液；

(2)將硝酸鉛與HEPES緩沖液按照10.25mg∶1mL的比例混合，形成Pb²⁺溶液；

(3)將所述步驟(1)中得到的金屬鰲合劑溶液和所述步驟(2)中得到的Pb²⁺溶液按照體積比為1∶1混合，調節混合液pH值至7.0，然后在23～27℃條件下振蕩反應10～14h，形成Pb-ITCBE鰲合物半抗原；

(4)將BSA、EDC與PBS緩沖液混合攪拌得到混合液，BSA質量、EDC質量與PBS緩沖液的體積比為66mg∶11.6mg∶5mL，將所述混合液與乙二胺按照混合液體積和乙二胺質量比為5mL∶7mg的比例混合，37℃振蕩反應2h得反應液；反應液用PBS透析4d，得到活化的載體蛋白BSA；

(5)將所述活化的載體蛋白BSA和pH值為8.0的HEPES緩沖液混合，形成濃度為30mg/mL的載體蛋白溶液；

(6)將所述步驟(3)中得到的Pb-ITCBE鰲合物半抗原溶液和所述步驟(5)得到的載體蛋白溶液按照體積比為1∶1的比例混合，調節pH值至9.0，23～27℃條件下振蕩反應22～26h，將得到的反應液裝入透析袋，先用蒸餾水透析2d，再用PBS透析3d，即形成Pb-ITCBE-cBSA免疫原；

所述酶標Pb-ITCBE鰲合物半抗原的制備方法包括以下步驟：

A.將異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸與二甲基亞砜混合形成金屬鰲合劑溶液；

B.將硝酸鉛與HEPES緩沖液混合，形成Pb²⁺溶液；

C.將所述步驟A中得到的金屬鰲合劑溶液和所述步驟B中得到的Pb²⁺溶液混合，調節混合液的pH值至7.0～7.2，得到的混合液振蕩反應10～14h，形成Pb-ITCBE鰲合物半抗原；

D.將標記用酶與HEPES緩沖液混合，得到酶溶液；

E.將所述步驟C得到的Pb-ITCBE鰲合物半抗原溶液與所述步驟D中得到的酶溶液混合，調節混合物的pH值至8.8～9.2，再將混合液振蕩反應22～26h，得到酶標Pb-ITCBE螯合物半抗原；

所述步驟A、B和D之間沒有時間順序的限制；

所述C和D之間沒有時間順序的限制。

2.權利要求1所述鉛離子檢測試劑盒在檢測環境中鉛離子的應用，其特征在于，包括以下步驟：

a、將抗鉛離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Pb-ITCBE鰲合物半抗原溶液加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的檢測板孔內，混合，孵育后用洗滌液洗滌；

b、向檢測板中加入底物顯色液，孵育，加入終止液混合，測定OD值；

c、根據所述步驟b得到的OD值與預定的標準曲線，得到待測樣品中鉛離子的濃度，所述標準曲線是鉛離子濃度與OD值之間的線性關系曲線。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測板孔內抗鉛離子單克隆抗體溶液、稀釋的待測樣品溶液和酶標Pb-ITCBE鰲合物半抗原溶液的體積比為1～2∶1～2∶1～2。