[發(fā)明專利]細(xì)菌性莢膜多糖的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710098943.6
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN107043431B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祝先潮;陳春光
• 申請（專利權(quán)）人: 上海瑞宙生物科技有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 上海翼勝專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

本發(fā)明公開細(xì)菌性莢膜多糖的純化方法，滅活劑處理肺炎鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)液，加酸調(diào)節(jié)pH值≤6.5，沉淀雜質(zhì)，離心和微濾去除沉淀物獲得多糖澄清液；用截留分子量10—100KDa的膜對多糖澄清液進(jìn)行超濾換液并濃縮，獲得的莢膜多糖溶液組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析進(jìn)行色譜層析，獲得純化的莢膜多糖溶液；濃縮及超濾莢膜多糖溶液，并進(jìn)行無菌過濾、保存。通過組合使用復(fù)合型離子交換層析和羥基磷酸灰質(zhì)鹽層析，可有效降低蛋白質(zhì)及核酸雜質(zhì)到低于1％，純化的多糖產(chǎn)品質(zhì)量高于歐盟藥典標(biāo)準(zhǔn)要求，回收率在60％以上，本發(fā)明工藝簡單快捷，容易放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地講，涉及對細(xì)菌性莢膜多糖粗制品的純化方法。

背景技術(shù)

肺炎鏈球菌為革蘭氏陽性菌，有90多種血清型，其中大部分肺炎鏈球菌細(xì)菌表面包裹一層莢膜多糖。莢膜多糖可逃避免疫系統(tǒng)的識別，防止免疫細(xì)胞的吞噬作用，因而使得細(xì)菌能夠在體內(nèi)繁殖而致病。多年的研究和臨床證明，肺炎鏈球菌的莢膜多糖作為疫苗能誘導(dǎo)特異性抗體，對相應(yīng)的肺炎鏈球菌具有很好的免疫保護(hù)作用。不同血清型的肺炎鏈球菌的莢膜多糖的成分和結(jié)構(gòu)都不一樣，因而通常需要使用不同血清型的肺炎鏈球菌的多糖組合作為疫苗來預(yù)防主要肺炎鏈球菌的致病性。

用于制備多糖疫苗的肺炎鏈球菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，除了產(chǎn)生莢膜多糖之外，還產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物。為了滿足疫苗制備所必須的莢膜多糖純度，發(fā)酵液通常必須經(jīng)過多個純化步驟處理，將多糖粗制品中的蛋白、核酸、內(nèi)毒素等雜質(zhì)去除，從而避免后續(xù)接種疫苗可能引起的副反應(yīng)。

細(xì)菌莢膜多糖純化工藝的建立經(jīng)歷了多年的發(fā)展，傳統(tǒng)細(xì)菌莢膜多糖純化工藝采用冷酚萃取法去除蛋白質(zhì)，該方法需要較長的離心時(shí)間，且苯酚作為有一種具有極強(qiáng)腐蝕的試劑，可能腐蝕操作者的皮膚、粘膜甚至抑制操作者的中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能；且廢棄苯酚的處理，對環(huán)境保護(hù)來說存在著較嚴(yán)重的威脅。

乙醇分沉淀法通常能夠有效地去除多糖中的蛋白污染物，但是難以達(dá)到用于注射用的疫苗純度的要求。另外，乙醇的使用還會帶來以下問題：1)乙醇的使用需要防火設(shè)施，而設(shè)計(jì)這樣的設(shè)施成本很高；2)需要的乙醇量巨大，每升加工材料幾乎需要4-6L乙醇，并且廢液處理非常困難；3)處理后的多糖復(fù)溶困難，需要凍干等步驟。

專利US5714354提出了一種用無乙醇沉淀來純化肺炎球菌莢膜多糖的改進(jìn)方法。該方法是通過用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)來沉淀23種肺炎球菌血清型中的20個莢膜多糖，然后用活性炭過濾、羥基磷酸灰質(zhì)鹽(Hydroxyapatite)色譜法和陰離子交換色譜法來進(jìn)一步分離多糖中的雜質(zhì)，該純化工藝步驟能夠純化出大部分血清型莢膜多糖。該方法純化出來的所有23個血清型莢膜多糖的質(zhì)量達(dá)到多糖疫苗的質(zhì)量指標(biāo)。目前，CTAB已被廣泛用來選擇性的沉淀多糖，從而達(dá)到與蛋白及核酸分離的目的，如專利CN201510012526以及CN200910128141。然而，由于形成的CTAB-多糖復(fù)合物解離較為困難，工藝步驟多且繁瑣，影響了莢膜多糖的回收率。因此，在專利CN200910128141中，仍然采用純的乙醇或乙醇和水混合物來溶解CTAB-多糖復(fù)合物。

降低多糖發(fā)酵溶液的pH值也被專利CN200880012946以及CN201210112391公開用于選擇性沉淀蛋白質(zhì)、核酸，而不嚴(yán)重影響多糖產(chǎn)率。這樣純化方法的特點(diǎn)在于通過酸化這一步來將大部分的污染物(如蛋白、核酸等)和溶液中的莢膜多糖分離，簡化了后續(xù)工藝，縮短了純化時(shí)間。然而，我們發(fā)現(xiàn)獲得的制備的多糖不能符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，仍然需要進(jìn)一步純化，包括使用層析色譜吸附殘留的雜質(zhì)，以及微濾、超濾來獲得合格多糖。