[發(fā)明專利]一株過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌及構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710098815.1
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106636151A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何寧;劉沛澤;陳震
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N1/21;C12N9/10;C12N15/75;C12P19/04;C12R1/10
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所(普通合伙)35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程及微生物發(fā)酵，尤其是涉及一株過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases,Gtfs)是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶，主要負責將活性供體的單糖轉(zhuǎn)移到糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸分子上，完成糖基化反應(yīng)。已有研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶基因(epsB)是多糖生物合成過程中的重要基因，作用是參與多糖重復(fù)單元的聚合并決定多糖的鏈長(J Bacteriol,2003,185(20):6057-6066；Microbiology-Uk,1997,143:2395-2405)。

微生物絮凝劑(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能夠使懸浮液中的固體顆粒、菌體、細胞和膠狀物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等。微生物絮凝劑具有安全、高效、可生物降解和對環(huán)境無污染等優(yōu)勢，且能產(chǎn)生絮凝劑的微生物種類多、生長快、易于采用工程手段而實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此微生物絮凝劑的開發(fā)前景十分看好。目前，多糖生物絮凝劑已經(jīng)應(yīng)用于去除紡織印染廢水中的色素(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，還可以去除工業(yè)廢水中的重金屬離子和其它懸浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。然而多糖絮凝劑產(chǎn)量低、成本較高，制約著它的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。目前，對于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、生長因子等外部因素影響多糖絮凝劑合成的報道已經(jīng)很多(Process Biochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。而從地衣芽孢桿菌的遺傳及生理學(xué)角度對其多糖絮凝劑合成量影響的報道甚是少見。由于多糖絮凝劑結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且大多數(shù)針對多糖的研究并不關(guān)注絮凝活性，所以有關(guān)多糖絮凝劑代謝途徑的研究還較少，而通過分子生物學(xué)技術(shù)改造菌株提高多糖絮凝劑產(chǎn)量的報道幾乎沒有。因此通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)優(yōu)良菌株，進一步提高多糖絮凝劑活性及產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟價值及社會意義。

本申請人在中國專利200910111262.4提供了地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，該微生物已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2876。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中多糖絮凝劑絮凝活性不高、調(diào)控機理不明等問題，提供糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB。

本發(fā)明的第二目的在于提供一株過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌及構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三目的在于提供過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌在制備多糖絮凝劑中的應(yīng)用。

所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB利用PCR擴增克隆多糖絮凝劑合成途徑獲得，所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

所述過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌是將糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB片段連接到表達載體上，然后利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中，通過抗性篩選獲得過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌。所述表達載體為游離載體，優(yōu)選表達載體為PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表達載體的啟動子為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的啟動子PamyL。所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2876。

所述過表達糖基轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌的構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)設(shè)計PCR引物擴增糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsB；

2)將擴增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動子PamyL下游多克隆位點，得到PHY300-epsB過表達質(zhì)粒；

3)然后將PHY300-epsB過表達質(zhì)粒導(dǎo)入到E.coli DH5α中，以備擴增后電轉(zhuǎn)化；

4)將經(jīng)提取、濃縮后的PHY300-epsB過表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌，37℃復(fù)蘇5h后，涂布四環(huán)素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子；