[發明專利]一株過表達糖基轉移酶基因的工程菌及構建方法

在審

• 申請號: 201710098815.1
• 申請日: 2017-02-23
• 公開（公告）號: CN106636151A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 何寧;劉沛澤;陳震
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N1/21;C12N9/10;C12N15/75;C12P19/04;C12R1/10
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙)35200
• 代理人: 馬應森

1.糖基轉移酶基因epsB，其特征在于所述糖基轉移酶基因epsB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.過表達糖基轉移酶基因的工程菌，其特征在于是將糖基轉移酶基因epsB片段連接到表達載體上，然后利用電轉化的方法導入到地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中，通過抗性篩選獲得過表達糖基轉移酶基因的工程菌；所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2876。

3.如權利要求2所述過表達糖基轉移酶基因的工程菌，其特征在于所述表達載體為游離載體，表達載體為PHY300PLK-PamyL-TTamyL。

4.如權利要求3所述過表達糖基轉移酶基因的工程菌，其特征在于所述表達載體的啟動子為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的啟動子PamyL。

5.如權利要求2所述過表達糖基轉移酶基因的工程菌的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)設計PCR引物擴增糖基轉移酶基因epsB；

2)將擴增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動子PamyL下游多克隆位點，得到PHY300-epsB過表達質粒；

3)然后將PHY300-epsB過表達質粒導入到E.coli DH5α中，以備擴增后電轉化；

4)將經提取、濃縮后的PHY300-epsB過表達質粒電轉化地衣芽孢桿菌，37℃復蘇5h后，涂布四環素抗性平板，再在37℃培養12h，篩選轉化子；

5)轉化子經質粒提取后，利用PCR和雙酶切進行驗證，從而獲得過表達糖基轉移酶基因的地衣芽孢桿菌重組菌HN301-4。

6.如權利要求2所述表達糖基轉移酶基因的工程菌在制備多糖絮凝劑中應用。

7.如權利要求6所述應用，其特征在于所述表達糖基轉移酶基因的工程菌制備多糖絮凝劑的方法包括以下步驟：

1)刮一環地衣芽孢桿菌重組菌HN301-4接種于液體種子培養基中，35～37℃，200r/min培養12～16h，制備種子培養液；

2)按體積比，以4％的接種量接種于多糖絮凝劑發酵培養基中，在30～40℃，150～300r/min條件下培養50～60h，進行發酵產多糖絮凝劑實驗；

3)將所得發酵液離心收集上清液，將所得上清液用乙醇沉淀法，沉淀溶解于水后冷凍真空干燥即得。

8.如權利要求7所述應用，其特征在于在步驟2)中，按體積比，以4％的接種量接種于多糖絮凝劑發酵培養基中，在37℃，200r/min的條件下培養48～56h。

9.如權利要求7所述應用，其特征在于在步驟3)中，所述所述乙醇沉淀法的具體步驟為用三倍體積的乙醇提取，4℃靜置12h，離心的速度為6000～8000rpm，離心時間為10～15min，離心溫度為4℃。