[發明專利]重組枯草芽孢桿菌串聯表達禽流感病毒HA抗原片段和PB1－F2蛋白

在審

• 申請號: 201710098741.1
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN107119064A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 林建;黃金鳳;曾嚴;王志勝
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/75;C12N1/21;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/125
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一、技術領域

本發明涉及串聯表達禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術基因工程領域。具體包括：禽流感病毒HA-PB1-F2蛋白整合表達性質粒pInHAPB1的構建，禽流感病毒HA-PB1-F2蛋白的表達與鑒定以及重組枯草芽孢桿菌可以刺激雞骨髓源樹突狀細胞MHC11的表達發生顯著變化，誘導樹突狀細胞的成熟；也可以刺激SPF雛雞機體產生有效的HA-PB1-F2特異性免疫應答水平。

二、背景技術

1口服黏膜免疫研究進展

目前，在我國控制禽流感最實際有效的方法是使用全病毒滅活疫苗。原因是具有良好的安全性，抗原成分齊全和免疫原性強等特點。但是，傳統的疫苗接種(肌肉或皮下注射)具有以下缺點：①動物和人類的病毒需要在動物細胞中培養，這使得疫苗生產的成本非常高；②疫苗中的病原體可能在疫苗生產過程中沒有完全被殺死或完全減毒，從而導致疾病更大范圍的擴散；③減毒菌株可能發生突變；④有些疾病使用傳統疫苗控制效果不佳(如艾滋病)；⑤導致家禽的應激反應從而影響動物的生長；⑥傳統疫苗如果多次接種，會造成體內疫苗殘留導致肉類產品質量下降，間接影響食品安全和公共衛生；⑦禽流感感染主要通過呼吸道和胃腸道途徑，通過肌肉注射動物的滅活油乳劑疫苗，不能刺激呼吸道和消化道局部粘膜免疫。

新興的粘膜免疫，具有簡單，安全，方便等許多優點，引起國內外免疫學專家的關注，現已成為免疫學研究的熱點之一。一方面，粘膜免疫方法簡單安全，不僅在粘膜局部和其他粘膜組織產生免疫反應，而且還能引起全身性體液免疫反應；另一方面，有顯著的免疫效果，疫苗在口服免疫后通過上呼吸道粘膜相關淋巴組織不僅有效地誘導局部免疫反應，而且激活淋巴細胞歸巢到其他粘膜部位，誘導廣泛的粘膜免疫應答，防御病原微生物入侵，因此通過口服粘膜免疫能夠獲得好的效果。例如，口服脊髓灰質炎疫苗的應用，使得脊髓灰質炎的全球發病率得到了有效控制，為口服疫苗的開發和應用起到了引導作用。然而，在實踐中，口服粘膜免疫也存在不足，由于疫苗僅作用在粘膜表面，很少能有效地進入動物體，同時也受到膜表面粘液和其他等因素的影響，特別是在經過消化道粘膜時，疫苗很容易被破壞，影響免疫效果，這使得消化道粘膜免疫的使用和推廣得到了限制。近年來，疫苗遞送已成為傳染病防御領域的熱點之一。特別是細菌活載體疫苗因培養方便，外源基因容量大，能刺激細胞免疫力的優勢具有較大潛力。因此，理想的疫苗抗原載體的選擇是建立新的生物技術的關鍵。理想的抗原遞送載體應該能夠在體內長時間存在，本身是安全的并且可以產生持續免疫力。

2枯草芽孢桿菌對口服黏膜免疫的影響

近年來，疫苗遞送系統已成為預防傳染病領域的熱點之一。特別是細菌活載體疫苗因其培養方便，外源基因容量大，刺激細胞免疫等優點具有巨大的潛力。細菌活載體疫苗是新興的粘膜免疫疫苗的重要發展方向。通過使用細菌活載體疫苗，不僅能刺激腸道免疫反應，而且能夠針對特異性抗原產生特異性免疫反應，使機體得到全面保護。目前，研究比較廣泛的活菌載體有沙門氏菌、乳桿菌、李斯特菌等?？莶菅挎邨U菌是一種安全和非致病的活細菌載體，廣泛存在于土壤和植物中，許多研究表明，枯草芽孢桿菌不僅可以誘導腸粘膜免疫應答，也對動物和人的病原體有拮抗作用。作為抗原載體的枯草芽孢桿菌具有許多優點：①是一種安全非致病的益生菌；②有良好的安全性，抗逆性強(適合保存和運輸)；③生產方便(發酵條件簡單，產品易于分離和純化)；④遺傳操作系統成熟。因此，枯草芽孢桿菌非常適合用于安全口服疫苗和其它病原體的抗原遞送載體。同時，作為抗原遞送載體的枯草芽孢桿菌可以誘導粘膜免疫應答和全身免疫應答，這都使得應用枯草芽孢桿菌作為抗原遞送載體具有廣闊的前景。

3枯草芽孢桿菌對樹突狀細胞的影響