[發明專利]重組枯草芽孢桿菌串聯表達禽流感病毒HA抗原片段和PB1－F2蛋白

在審

• 申請號: 201710098741.1
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN107119064A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 林建;黃金鳳;曾嚴;王志勝
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/75;C12N1/21;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/125
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1.串聯表達禽流感病毒HA抗原片段和PB1-F2蛋白的重組枯草芽孢桿菌整合表達質粒pInHAPB1，是由以下方法構建而成：

1.1高致病性禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因的克隆；

以含有血凝素的質粒pCI-H5HA(哈爾濱獸醫研究所陳化蘭惠贈，NCBI編號是AF144305)為模板，設計引物進行PCR擴增。在上游引物引入與GFP末端16bp的同源臂序列；在下游引物引入與PB1-F2末端16bp的同源臂序列。

引物序列如下：

P1：GGCATGGATGAACTATACAAATACCATGCAAACAACTCG

P2：CACTTCCACCTCCACCGCAAATTCTGCATTGTAAC

PCR反應體系為50μL，PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR產物電泳鑒定回收后獲得禽流感H5N1病毒血凝素(HA)基因序列SEQ ID NO.1。

1.2高致病性禽流感H5N1病毒PB1-F2基因的合成：

參照已發表的H5N1的PB1-F2蛋白基因序列(GenBank登陸號：GU596982)，設計一對擴增PB1-F2蛋白基因的引物，在上游引物引入與HA 3’末端16bp的同源臂序列，在下游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 5’末端16bp的同源臂序列，在下游序列與載體之間引入BamH1酶切位點(下劃線為酶切位點)。

引物序列如下：

P3：GTGGAGGTGGAAGTAGGAGGATGGAACAGGAACAGG

P4：GGTACCAAGCTTTTAGGATCCTCCAGTTTATCCACTCTTG

參照已發表的H5N1的PB1-F2蛋白基因序列(GenBank登陸號：GU596982)，將PB1-F2序列送去南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以P3、P4為引物合成的PB1-F2為模板進行PCR擴增增強腸道DC活性的PB1-F2蛋白。PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR產物電泳鑒定回收后獲得低致病性禽流感H5N1病毒PB1-F2基因序列SEQ ID NO.2。

1.3融合HA和PB1-F2片段

用重疊PCR將擴增的HA與PB1-F2使用P1，P4引物以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為模板進行PCR擴增獲得目的片段HA-PB1-F2。PCR反應反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR產物電泳鑒定回收獲得HA-PB1-F2基因序列SEQ ID NO.3。

1.4綠色熒光蛋白基因GFP的克隆

參照已發表的綠色熒光蛋白基因序列(GenBank登陸號：KU312311.1)設計一對擴增綠色熒光蛋白基因GFP的引物，在上游引物引入與載體基因3’末端16bp的同源臂序列，兩序列之間引入Xba1酶切位點(下劃線為酶切位點)；在下游引物引入與HA蛋白5’末端16bp的同源臂序列，引物序列如下：

P5：AAGAAATACAAATCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACT

P6：TCGAGTTGTTTGCATGGTATTTGTATAGTTCATCCATGCC

以pINAmyE-CotG-GFPCOE-FimH質粒為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50μL，PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，30cycles，72℃10min，4℃10min；PCR產物電泳鑒定回收后獲得綠色熒光蛋白基因GFP的基因序列SEQ ID NO.4。

1.5整合表達載體pInHAPB1的構建

將回收的SEQ ID NO.3序列和SEQ ID NO.4序列使用One Step Cloning Kit定點克隆試劑盒克隆至載體骨架pInAmyE-CotG(Xba1和BamH1酶切后pINAmyE-CotG-GFPCOE-FimH膠回收獲得)。測序后獲得整合表達載體pInHAPB1。