[發明專利]一種對香豆酸-3-羥化酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201710098484.1
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106906189B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 汪仁;李宜奎;錢彬彬;徐晟;李曉丹;程麗;夏冰
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P7/42
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明涉及對香豆酸?3?羥化酶及其編碼基因與應用。本發明首次揭示了石蒜屬植物忽地笑的對香豆酸?3?羥化酶，其具有良好的底物專一性和區域選擇性，可以催化對香豆酸的3位C的羥基化生成咖啡酸。本發明還揭示了編碼所述對香豆酸?3?羥化酶的多核苷酸，表達所述對香豆酸?3?羥化酶的載體與宿主細胞，以及生產咖啡酸的方法。

技術領域

本發明涉及生物技術和植物生物學領域；更具體地，本發明涉及一種來源于石蒜科植物的對香豆酸-3-羥化酶及其編碼基因與應用。

背景技術

植物細胞色素P450酶(Cytochrome P450 enzymes，CYPs)參與大量植物天然產物的生物合成，是天然產物生物合成的關鍵酶之一，屬于亞鐵血紅素單加氧酶超大家族，催化多種類型的氧化還原反應，具有結構選擇性、區域選擇性和立體選擇性。CYPs的催化活性依賴于細胞色素P450還原酶。細胞色素P450還原酶可以將電子供體(還原力)中的電子傳遞給CYPs，協助CYPs進行一系列的結構專一性、區域專一性和立體專一性生物反應。

對香豆酸-3-羥化酶是植物細胞色素P450酶，屬于CYP98亞家族，催化對香豆酸3位C的羥基化生成咖啡酸。作為一種苯酚衍生物，咖啡酸是植物苯丙素類天然產物，具有抗氧化、抗病毒、抗癌及抗炎等多種生物醫藥活性，用于臨床及醫藥、食品和化妝品等行業。在臨床上，咖啡酸用于預防手術時出血以及出血性疾病的止血。在醫藥上，咖啡酸是一種止血升白細胞藥，具有收縮微血管、提高凝血因子以及升高白細胞和血小板的作用，用于白細胞減少癥和血小板減少癥等。在化妝品中，低濃度的咖啡酸具有抑制皮膚黑色素生成的效用。作為一個多功能的藥效基團和平臺化合物，咖啡酸還可以衍生出大量具有醫藥活性的化合物。例如，咖啡酸是蜂膠主要活性成分之一——咖啡酸苯乙酯和金銀花主要抗菌、抗病毒有效藥理成分之一——綠原酸等物質合成的前體物質，還可以用于臨床上治療輕、中度老年癡呆癥的藥物——加蘭他敏的合成。咖啡酸具有廣泛的應用和需求。

忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根藥用植物，屬于石蒜科石蒜屬，能夠合成咖啡酸等具有重要生物活性和應用價值的大量植物天然產物。但是，石蒜屬植物對香豆酸-3-羥化酶及其編碼基因尚未被分離與克隆。因此，本領域有必要開發石蒜屬植物忽地笑的對香豆酸-3-羥化酶。該蛋白及其編碼基因可通過植物轉基因和異源表達的方式進行咖啡酸的生物轉化與生物合成。

發明內容

本發明的目的在于提供一種石蒜科植物的對香豆酸-3-羥化酶，所述的對香豆酸-3-羥化酶選自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白質；或

(b)將SEQ ID NO：1氨基酸序列經過一個或多個(如1-30個)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而形成的，且具有對香豆酸-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質；或

(c)與SEQ ID NO：1氨基酸序列有至少75％序列相同性，且具有對香豆酸-3-羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明SEQ ID NO：1所示的蛋白質是從忽地笑(Lycoris aurea)中分離得到的一種新的對香豆酸-3-羥化酶(p-Coumaric acid-3-Hydroxylase)。為便于表述，將SEQ IDNO：1所示的蛋白質命名為LaC3H。

在一個優選例中，所述的對香豆酸-3-羥化酶活性是指以對香豆酸為底物合成咖啡酸。

在另一個優選例中，所述的序列(c)還包括：由(a)或(b)添加了標簽序列、信號序列或分泌信號序列后所形成的融合蛋白。

本發明的另一目的在于提供分離的多核苷酸，該多核苷酸是編碼所述對香豆酸-3-羥化酶的多核苷酸。

在一個優選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。