[發明專利]一種弓形蟲病間接ELISA診斷試劑盒

有效

• 申請號: 201710098062.4
• 申請日: 2017-02-22
• 公開（公告）號: CN106970210B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 陳兆國;程龍;黃燕;米榮升;韓先干;陸珂
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;G01N33/53
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

本發明公開了一種弓形蟲病間接ELISA診斷試劑盒；所述診斷試劑盒中所用的檢測抗原為核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的弓形蟲TgPP1基因原核表達獲得的重組蛋白rTgPP1。本發明的試劑盒的包被抗原是原核表達的rTgPP1蛋白，在低溫誘導下，它以可溶性的形式存在，而且在N端帶有His標簽，這有利于大量純化rTgPP1蛋白，從而使抗原來源不再受約束；本發明使用重組抗原代替天然抗原作為包被抗原，應用于ELISA檢測以及制備ELISA試劑盒，可以顯著提高不同批次間抗原的穩定性，還具有較好的特異性和重復性，為流行病學調查和疾病診斷提供了一種快速有效的檢測方法。

技術領域

本發明涉及一種優化的弓形蟲TgPP1基因和一種弓形蟲病間接ELISA診斷試劑盒。

背景技術

弓形蟲病(toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)引起的人獸共患寄生蟲病，弓形蟲屬頂端復合門(Apicomplexa)、類錐體綱(Conoidasida)、球蟲亞綱(Coccidia)、真球蟲目(Eucoccidiorida)、艾美耳亞目(Eimeriorina)、肉孢子蟲科(Sarcocystidae)、弓形蟲屬(Toxoplasma)，是一種細胞內寄生性原蟲，可寄生在除紅細胞外幾乎所有有核細胞中，呈全球性分布。據血清學統計分析，全世界約25％～50％的人感染弓形蟲。弓形蟲可造成人體多種器官病理損害，甚至危及生命。免疫功能正常的宿主感染后多呈無癥狀帶蟲狀態；對于免疫損傷和缺陷的個體，如艾滋病患者，其感染可能是致命的，孕婦感染可致流產、早產、死胎或畸胎。弓形蟲主要通過口、母嬰和血液傳播感染宿主。

由于弓形蟲病的臨床癥狀無明顯特異性，且多呈現隱性感染，故依據臨床癥狀和流行病學難以作出診斷。目前弓形蟲病主要依據實驗室診斷，主要方法有病原學檢查、免疫學檢測和分子生物學技術。病原學檢查是從病料中直接檢查速殖子或卵囊，主要包括：直接涂片或組織切片檢查、動物接種和卵囊檢查法；免疫學檢測包括：染色試驗、間接血凝試驗、乳膠凝集試驗、間接免疫熒光試驗、酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)等；分子生物學方法主要指PCR技術。血清學診斷方法是目前弓形蟲病檢測的主要手段，其中ELISA法具有操作簡便、靈敏性高、快速、易標準化等特點，已成為首選的常規診斷方法，所用抗原大多為表面蛋白或分泌蛋白等可溶性抗原。然而目前我國市場上銷售的弓形蟲病診斷試劑盒品種繁雜、質量參差不齊，既無統一標準，又無序生產與使用，給弓形蟲病的診斷與防治造成嚴重危害。綜合起來，我國弓形蟲病診斷試劑盒存在交叉反應嚴重、敏感性和特異性低、符合率不高等問題。

弓形蟲入侵宿主時，要通過速殖子(tachyzoite)頂端復合體接觸宿主細胞膜，借助隨后分泌的一些分泌蛋白侵入細胞、形成帶蟲空泡(parasitophorous vacuole)，并在胞漿或細胞核內進行內裂殖、二分裂和玫瑰花斑式繁殖，最終裂解細胞，又侵入新的宿主細胞進行不斷地發育和繁殖，同時也導致宿主細胞不斷的破壞而致病。此過程依賴于磷酸化和脫磷酸化作用，這些蛋白修飾是囊泡運輸(vesicular trafficking)、分泌，以及肌動蛋白-肌球蛋白動力等的信號通路調節因子。早在1997年，Dobrowolski等即發現，肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light chain kinase)抑制物KT5926影響弓形蟲速殖子的移動和對宿主細胞的黏附。Delorme等(2002)發現，I型和2A型蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP)的抑制物岡田酸(okadaic acid，OA)、泰托霉素(tautomycin)能明顯地影響I型弓形蟲速殖子的入侵，抑制率可達50％左右；速殖子的可溶性提取物具有I型蛋白磷酸酶(proteinphosphatase 1，PP1)的活性，且可與抗人PP1催化亞單位抗體反應；體外磷酸鹽標記試驗證實，弓形蟲PP1能催化多種蛋白的磷酸化反應。

目前，國內外還沒有學者運用重組TgPP1(recombinant TgPP，rTgPP1)蛋白建立豬弓形蟲病的ELISA診斷技術。

發明內容