[發明專利]一種基于焦磷酸測序檢測雙位點SNP的方法

有效

• 申請號: 201710097160.6
• 申請日: 2017-02-22
• 公開（公告）號: CN107043812B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 劉丹;孫悅;陳立波
• 申請（專利權）人: 武漢菲思特生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 熊嫻;馮子玲

本發明公開了一種基于焦磷酸測序檢測雙位點SNP的方法，該方法基于SNP位點之間的差異，設計對應的引物進行擴增后進行檢測，可同時對兩個SNP位點進行焦磷酸測序。本發明提供的基于焦磷酸測序檢測雙位點SNP的方法可以同時檢測兩個SNP位點，隨機成功率高，節約了一倍的人力物力，且結果可視化、準確率高，降低了檢測成本，滿足了臨床上雙位點同時檢測的需要，也為未來多位點的焦磷酸測序檢測SNP檢測奠定了理論基礎，具有良好的推廣價值。

技術領域

本發明涉及一種基于焦磷酸測序檢測雙位點SNP的方法，屬于單核苷酸多態性檢測領域。

背景技術

單核苷酸的多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最為常見的一種遺傳多態性，占所有已知多態性的的90％以上。現有公共數據庫中已經報道了超過900萬個SNP位點。開展SNP研究對遺傳學、醫學、藥物開發與合理用藥、臨床診斷、法醫學的發展均具有十分重要的意義。作為第三代遺傳標記，SNP具有穩定遺傳、高密度、容易規模化和自動化分析等前兩代遺傳標記無可比擬的優點。SNP分型檢測工作，已成為當前國際上研究的熱點。近年來，SNP檢測方法和相關儀器的研發進展很快。目前，進行SNP分型檢測的基本方法已達20余種。各種SNP分型檢測方法可看成由等位基因特異性識別的原理方法和等位基因識別產物的分析檢測兩部分組成。等位基因特異性識別原理有引物延伸反應原理、序列雜交反應原理、酶連接反應原理、酶切割反應原理等；等位基因分析檢測手段有質譜、熒光共振和偏振信號檢測、化學發光檢測、生物傳感器檢測等。為了提高方法的特異性和靈敏度，絕大多數的基因分型方法都需要對目標檢測序列片段進行PCR擴增從而增加檢測靶標分子的數目。等位基因識別反應在溶液中更為穩定，但在固相載體上捕獲反應產物能夠使大量檢測平行進行，從而極大提高分析的通量。雖然兩個部分操作可以在一定的條件下同時進行，但是為了提高檢測的精確性和靈敏度，大多數的分型方法都將兩個操作過程分離進行。

焦磷酸測序(preosequencing)技術是近年來發展起來的一種新的DNA序列分析技術，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光并進行檢測。是一個理想的遺傳分析技術平臺，既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的單核苷酸多態性(SNP)檢測及等位基因頻率測定等，該項技術目前已被廣泛應用于醫學生物等各個領域。

焦磷酸測序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應體系的酶級聯化學發光反應，反應底物為5’-磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate，APS)和熒光素。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。硫酸化酶催化ASP和PPi形成ATP，后者驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化，發出與ATP量成正比的可見光信號，并由Pyrogram^TM轉化為一個峰值，其高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。根據加入dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核苷酸序列。在實驗過程中用α-硫化的三磷酸腺苷(dATPαS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被蟲熒光素識別。由于SpdATPαS可以降低dATPαS降解產物的濃度，近年來，單鏈DNA結合蛋白(single starnd DNA binding portein，SSBP)和純化SpisomerdATPaS的使用dATPαS降解產物抑制雙磷酸酶活性的這一問題得到較好解決，使得測序長度可達10bp，拓展了該技術在遺傳學領域的應用范圍。