[發(fā)明專利]一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法

在審

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• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106967678A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設計）人: 韋玉軍;李航;陸寶石;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫(yī)學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61L27/38;A61L27/24;A61L27/58
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術領域

本發(fā)明涉及組織工程關節(jié)軟骨損傷修復治療領域，具體來說是一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法。

背景技術

關節(jié)軟骨缺損在臨床較為常見，目前治療關節(jié)軟骨缺損的主要方法均有明顯缺陷,軟骨損傷目前的治療方法包括軟骨成形術、骨髓刺激技術（即微裂縫），自體骨軟骨移植、自體軟骨細胞移植療法等。

骨髓刺激技術臨床上一般用于年輕患者較小的病變，其也顯示出巨大的成功,自體骨軟骨移植通常是用于給患者較小的病變,骨軟骨移植也被用于較大的軟骨損傷的治療，但這種技術的使用受移植物來源的限制，造成供體部位的額外損傷，修復后過度生長，骨膜增生，同時有疾病傳播的風險。

第一代的細胞療法即自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI），將自體軟骨細胞懸液注入缺損中以修復損傷。大量的研究表明，ACI技術可顯著改善運動功能，減輕癥狀，產生透明樣軟骨。但是這種技術需取健康的骨膜縫合固定，對健康組織產生影響，且技術復雜，手術時間長，存在修復后過度生長，骨膜增生，骨膜脫落，細胞流失等風險，限制了這種技術的應用。第二代細胞療法采用一種可吸收的膠原膜覆蓋軟骨缺損，替代自體健康骨膜組織，這種技術與第一代的細胞療法具有類似的療效，減少了對健康組織的損害。但其仍需兩次手術，仍需縫合，技術相對復雜，細胞分布不均衡，存在細胞流失的風險。

第三代細胞療法將培養(yǎng)的自體軟骨細胞種植在可吸收的膠原膜上，通過纖維蛋白膠固定于損傷處,無需縫合，手術時間顯著縮短，療效顯著，不受損傷面積的限制，臨床效果持久，克服了第一、第二代ACI技術的缺點。但是仍需二次手術，治療費用高昂。

另一方面，隨著組織工程技術的發(fā)展，干細胞技術日益成熟，其在醫(yī)學上應用也越來越被關注,由于干細胞具有組織全能性，能分化成各種組織細胞，尤其是可分化成軟骨細胞，這使其在臨床上應用于修復軟骨損傷成為可能。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術中的治療效果差、成本高的缺陷，提供一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法來解決上述問題。

本發(fā)明公開了一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法，具體步驟為：

（1）、在無菌條件下，用內含1ml肝素鈉生理鹽水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去針頭后，加入含10ml DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，混勻后得到骨髓懸液，備用；

（2）、在無菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封帶入實驗室中，然后將外周血置于50ml離心管中，在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，再對上清離心30min，去沉淀，0.22 μm孔徑過濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（3）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細胞分離液的離心管中，進行梯度離心，即在2000rpm的條件下，離心20min；

（4）、 吸取中間白膜層，再加入50ml PBS吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50ml PBS吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min， 棄上清，得到的沉淀即為目的細胞；

（5）、向DMEM高糖培養(yǎng)基中加入FGF-2、自體血清、慶大霉素，直至DMEM高糖培養(yǎng)基中的FGF-2的質量濃度為10 ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質量濃度為45ug/ml為止，然后將目的細胞加入15ml含10 ng/ml FGF-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的DMEM高糖培養(yǎng)基中，吹打計數(shù)，以5×10⁵/cm²接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每三天更換一次DMEM高糖培養(yǎng)基，該DMEM高糖培養(yǎng)基同樣含10 ng/ml FGF-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml；

（6）、細胞貼壁達到90%以上后，吸干培養(yǎng)液，用PBS液輕洗細胞兩次；

（7）、向培養(yǎng)瓶內加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的質量濃度為0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的質量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細胞為止，然后置于37℃，5%的CO₂溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮，細胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里滴入3-5ml高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化；