[發明專利]一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法

在審

• 申請號: 201710094041.5
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106967678A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 韋玉軍;李航;陸寶石;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61L27/38;A61L27/24;A61L27/58
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

1.一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法，其特征在于：具體步驟為：

（1）、在無菌條件下，用內含1ml肝素鈉生理鹽水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去針頭后，加入含10ml DMEM高糖培養基的培養瓶中，混勻后得到骨髓懸液，備用；

（2）、在無菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封帶入實驗室中，然后將外周血置于50ml離心管中，在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，再對上清離心30min，去沉淀，0.22 μm孔徑過濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（3）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細胞分離液的離心管中，進行梯度離心，即在2000rpm的條件下，離心20min；

（4）、 吸取中間白膜層，再加入50ml PBS吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50ml PBS吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min， 棄上清，得到的沉淀即為目的細胞；

（5）、向DMEM高糖培養基中加入FGF-2、自體血清、慶大霉素，直至DMEM高糖培養基中的FGF-2的質量濃度為10 ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質量濃度為45ug/ml為止，然后將目的細胞加入15ml含10 ng/ml FGF-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的DMEM高糖培養基中，吹打計數，以5×10⁵/cm²接種于T25細胞培養瓶中，置于37℃，5%的CO₂培養箱中培養，以后每三天更換一次DMEM高糖培養基，該DMEM高糖培養基同樣含10 ng/ml FGF-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml；

（6）、細胞貼壁達到90%以上后，吸干培養液，用PBS液輕洗細胞兩次；

（7）、向培養瓶內加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的質量濃度為0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的質量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細胞為止，然后置于37℃，5%的CO₂溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮，細胞間隙增大，再向培養瓶里滴入3-5ml高糖DMEM培養基終止消化；

（8）、用吸管反復吹打瓶底，使細胞脫落，再將細胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，再將細胞懸液轉移到50ml離心管內，再加入45ml高糖DMEM培養基，在1200rpm的條件下，離心7min，去上清后，重復上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向DMEM高糖培養基中加入FGF-2、自體血清、慶大霉素，直至DMEM高糖培養基中的FGF-2的質量濃度為10 ng/ml、自體血清的體積濃度為10%、慶大霉素的質量濃度為45ug/ml為止，用含10 ng/ml FGF-2、10%自體血清、慶大霉素45ug/ml的高糖DMEM培養基調節細胞濃度為1×10⁸/L，將細胞接種于75cm²細胞培養瓶內繼續培養；

（10）、細胞培養3-4周后，細胞傳代3次；

（11）、吸干培養液，向培養瓶內加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的質量濃度為0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的質量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細胞為止，然后置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮，細胞間隙增大，再向培養瓶里滴入3-5ml高糖DMEM培養基終止消化；

（12）、將細胞懸液在1200rpm的條件下，離心7min，棄上清，再用生理鹽水洗滌細胞3次；

（13）、用0.3-1ml生理鹽水重懸細胞，得到細胞懸液；

（14）、取無菌干燥豬源Ⅰ/Ⅲ型膠原膜并修剪成與軟骨損傷處一樣的形狀，置于無菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根據膜的面積，細胞數約2×10⁶/cm²，用塑料套管緩慢滴加細胞懸液于準備好的豬源Ⅰ/Ⅲ型膠原膜的糙面上，直至膠原膜達到濕飽和狀態；

（15）、待膠原膜吸附細胞10-15min后，即可。

2.根據權利要求1所述的一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法，其特征在于：所述的步驟（1）中，所述的肝素鈉生理鹽水的濃度為1200U/ml。

3.根據權利要求1或2所述的一種接種自體骨髓間充質干細胞的膠原膜的制備方法，其特征在于：所述的步驟（1）中，所述的DMEM高糖培養基中含有慶大霉素，所述的DMEM高糖培養基中的慶大霉素的濃度為45ug/ml。