[發明專利]基質誘導的自體骨髓間充質干細胞復合支架的制備方法

在審

• 申請號: 201710094014.8
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106975105A
• 公開（公告）日: 2017-07-25
• 發明（設計）人: 韋玉軍;李航;陸寶石;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/24;A61L27/50;A61L27/54;A61L27/58;C12N5/0775
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術領域

本發明涉及組織工程關節軟骨損傷修復治療領域，具體來說是一種基質誘導的自體骨髓間充質干細胞復合支架的制備方法。

背景技術

關節軟骨損傷在臨床上是一種常見的疾病，臨床表現為關節疼痛，負重、運動則加重，限制了患處關節的活動,多發病于運動員、年老者,由于關節軟骨是透明軟骨，缺乏血管、淋巴、神經營養等，因此很難自我修復,一旦發病，則往往發展為骨性關節炎，重者需要人工關節置換。

這一疾病的治療以前有過多種治療手段，包括清創術、骨髓刺激術（如微骨折術、軟骨下骨鉆孔術等）、自體或異體軟骨膜和骨膜移植術、骨軟骨移植術、關節軟骨移植術等,但這些技術修復組織多以纖維軟骨為主、缺乏正常透明軟骨的力學性能及耐用性，同時也常常會出現一些并發癥如修復后過度生長、骨膜增生、關節肥大、損壞正常組織、疾病傳染等。

隨著自體軟骨細胞移植技術（Autologous chondrocyte implantation, ACI）的成熟，軟骨損傷修復治療逐漸進入組織工程修復領域,第一代ACI技術多采用自體骨膜瓣，易形成骨膜肥大，骨膜增生伸入關節腔往往需要二次手術切除,移植的骨膜也使軟骨下骨密度增加，導致新生軟骨組織退化，移植的骨膜生成的透明軟骨樣組織的生物力學性能、耐磨持久性不佳，易蛻變，整個手術過程操作復雜，費用高昂。

第二代細胞療法采用一種可吸收的支架替代自體骨膜，減少了對健康組織的損害,但其仍需兩次手術，仍需縫合，技術相對復雜，細胞分布不均衡，存在細胞流失的風險。

第三代的細胞療法則對以上技術進一步優化，將自體軟骨細胞移植入一種可吸收的膜支架，并繼續培養一些天，可使細胞均勻分布于膠原膜中,然后將這一細胞膠原膜植入軟骨損傷處進行修復，被稱為基質誘導的自體軟骨細胞移植技術（Matrix-induced autologous chondrocyte implantation (MACI)）,這一技術術后恢復時間短，操作簡便、創傷小、修復面積達，可達20cm²，術后產生更多的透明軟骨,治療效果較為理想,這也避免了之前技術所引起的并發癥。然而MACI技術仍然需要采集患者自體軟骨細胞，損壞正常軟骨組織，仍需二次手術，增加了患者痛苦，同時治療費用昂貴。

另一方面，隨著組織工程技術的發展，干細胞技術日益成熟，其在醫學上應用也越來越被關注。由于干細胞具有組織全能性，能分化成各種組織細胞，尤其是可分化成軟骨細胞，這使其在臨床上應用于修復軟骨損傷成為可能。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中的檢測精確度差、靈敏度不足的缺陷，提供一種基質誘導的自體骨髓間充質干細胞復合支架的制備方法來解決上述問題。

本發明公開了一種基質誘導的自體骨髓間充質干細胞復合支架的制備方法，具體步驟為：

（1）、在無菌條件下，使用20ml的注射器，將1ml肝素鈉生理鹽水抽吸入注射器內，然后繼續使用注射器抽入骨髓9ml，去掉針頭后，將肝素鈉生理鹽水和骨髓加入含10ml DMEM高糖培養基的培養瓶中，混合均勻后，得到骨髓懸液；

（2）、在無菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；

（3）、將患者的外周血分裝于50ml離心管中，每管45ml,在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，將上清離心30min，去沉淀，經0.22μm孔徑過濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（4）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細胞分離液的離心管中，在2000rpm的條件下，離心20min，然后吸取中間白膜層，然后向白膜層內加入50ml PBS，并吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50ml PBS吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細胞；

（5）、向DMEM高糖培養基內加入自體血清和硫酸慶大霉素，DMEM高糖培養基中的自體血清的體積濃度為10%，DMEM高糖培養基中的硫酸慶大霉素的濃度為40U/ml，然后取15ml 含自體血清和硫酸慶大霉素的DMEM高糖培養基加入到目的細胞內，然后將細胞吹打均勻，并計數，以5×10⁵/ cm²接種于T25細胞培養瓶中，置于37℃，5%的CO₂培養箱中培養，以后每三天更換一次DMEM高糖培養基,該DMEM高糖培養基也含10%自體血清和40U/ml硫酸慶大霉素；