[發明專利]基質誘導的自體骨髓間充質干細胞復合支架的制備方法

在審

• 申請號: 201710094014.8
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106975105A
• 公開（公告）日: 2017-07-25
• 發明（設計）人: 韋玉軍;李航;陸寶石;蘇軍;吳遠航
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/24;A61L27/50;A61L27/54;A61L27/58;C12N5/0775
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

1.一種基質誘導的自體骨髓間充質干細胞復合支架的制備方法，其特征在于：具體步驟為：

（1）、在無菌條件下，使用20ml的注射器，將1ml肝素鈉生理鹽水抽吸入注射器內，然后繼續使用注射器抽入骨髓9ml，去掉針頭后，將肝素鈉生理鹽水和骨髓加入含10ml DMEM高糖培養基的培養瓶中，混合均勻后，得到骨髓懸液；

（2）、在無菌條件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；

（3）、將患者的外周血分裝于50ml離心管中，每管45ml,在3000rpm的條件下，離心30min，取上清，在3000rpm的條件下，將上清離心30min，去沉淀，經0.22μm孔徑過濾除菌，得到自體血清，分裝待用；

（4）、將骨髓懸液沿管壁緩慢加入含20ml細胞分離液的離心管中，在2000rpm的條件下，離心20min，然后吸取中間白膜層，然后向白膜層內加入50ml PBS，并吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，再加入50ml PBS吹打均勻，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清，得到的沉淀即為目的細胞；

（5）、向DMEM高糖培養基內加入自體血清和硫酸慶大霉素，DMEM高糖培養基中的自體血清的體積濃度為10%，DMEM高糖培養基中的硫酸慶大霉素的濃度為40U/ml，然后取15ml 含自體血清和硫酸慶大霉素的DMEM高糖培養基加入到目的細胞內，然后將細胞吹打均勻，并計數，以5×10⁵/ cm²接種于T25細胞培養瓶中，置于37℃，5%的CO₂培養箱中培養，以后每三天更換一次DMEM高糖培養基，該DMEM高糖培養基也含10%自體血清和40U/ml硫酸慶大霉素；

（6）、 細胞貼壁達到80%以上后，吸干培養液，用PBS液輕洗細胞兩次；

（7）、向培養瓶內加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的質量濃度為0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的質量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細胞為止，置于37℃，5%的CO₂溫箱2-3min后，倒置在顯微鏡下，觀察到細胞回縮、細胞間隙增大時，再向培養瓶里滴入5ml高糖DMEM培養基終止消化；

（8）、用吸管反復吹打瓶底，使細胞從瓶壁上脫落，再將細胞懸液轉移到50ml離心管內，再加入45ml高糖DMEM培養基，離心7min，去上清后，重復上述步驟兩次，即得到清洗后的沉淀；

（9）、向DMEM高糖培養基內加入自體血清和硫酸慶大霉素，DMEM高糖培養基中的自體血清的體積濃度為10%，DMEM高糖培養基中的硫酸慶大霉素的濃度為40U/ml，然后取含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖DMEM培養基調節細胞濃度為1×10⁸/L，將細胞接種于75cm²細胞培養瓶內繼續培養；

（10）、細胞培養3-4周后，細胞傳代3次；

（11）、 吸干培養液，向培養瓶內加入胰蛋白酶- EDTA 溶液，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的胰蛋白酶的質量濃度為0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的質量濃度為0.01%，直至覆蓋所有細胞為止，置于溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮，細胞間隙增大時，再向培養瓶里滴入高糖DMEM培養基終止消化；

（12）、將細胞懸液離心7min，棄上清，再用PBS洗滌細胞3次；

（13）、細胞計數，向DMEM高糖培養基內加入自體血清和硫酸慶大霉素，DMEM高糖培養基中的自體血清的體積濃度為10%，DMEM高糖培養基中的硫酸慶大霉素的濃度為40U/ml，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖DMEM培養基重懸細胞，調整細胞濃度為5×10⁶/ml；

（14）、向DMEM高糖培養基內加入自體血清和硫酸慶大霉素，DMEM高糖培養基中的自體血清的體積濃度為10%，DMEM高糖培養基中的硫酸慶大霉素的濃度為40U/ml，取一個無菌豬源Ⅰ/Ⅲ型膠原膜，糙面朝上，光面朝下放置于無菌塑料培養皿中，然后用含自體血清、硫酸慶大霉素的高糖DMEM培養基浸泡過夜；

（15）、將步驟（13）制備得到的細胞懸液滴入準備好的豬源Ⅰ/Ⅲ型膠原膜上，細胞數約1×10⁶/cm²，繼續培養3天，即可。