[發(fā)明專利]一種基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定方法

有效

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• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN108410963B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 朱挺兵;陳亮;楊德國;朱永久;何勇鳳;吳興兵
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

本發(fā)明公開了一種基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定方法，包括以下步驟：1.提取待檢測樣本的基因組DNA；2.利用引物組合進行多重PCR擴增反應，通過測序儀進行等位基因分型；3.通過似然率檢測待測個體與親本基因型之間的相關性，確定親子關系。與傳統(tǒng)PCR方法相比，本方法檢測的微衛(wèi)星位點提高了3倍左右，大大提高了親子鑒定的效率和速度，并且檢測費用也僅為原來的三分之一左右，同時克服了利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分型中等位基因大小判讀誤差等問題，提高了基因型數(shù)據(jù)的準確性，分析結(jié)果表明100%的待測個體均能夠正確的找到其父母本。

技術領域

本發(fā)明屬于魚類分子標記技術領域，具體涉及一種長鰭吻鮈的微衛(wèi)星熒光多重PCR親子鑒定方法。

背景技術

長鰭吻鮈(Rhinogobio ventralis Sauvage et Dabry)，隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鮈亞科(Gobioninae)、吻鮈屬(Rhinogobio)，俗稱洋魚、土耗兒，主要分布于長江上游干流、金沙江、雅礱江、岷江、沱江、嘉陵江中下游和烏江下游。其喜生活于河流底層，是一種具有較高營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值的長江上游珍稀特有魚類。近年來，由于過度捕撈、水域污染、生境破壞、水利工程建設等人類活動，長鰭吻鮈的資源量急劇下降。從受威脅程度、遺傳多樣性、物種價值等方面進行定量評估發(fā)現(xiàn)，長鰭吻鮈已達3級急切保護狀，被列為低危魚類。為保護此種長江上游珍稀特有魚類資源，開展人工增殖放流是恢復和增殖長鰭吻鮈自然種群資源的必要措施，而且多個水電工程已將長鰭吻鮈列為增殖放流對象，對長鰭吻鮈人工馴養(yǎng)、繁殖技術等方面的研究日益受到重視。長鰭吻鮈的人工繁殖是開展增殖放流的前提條件，但人工繁殖工作如果在沒有考慮其遺傳背景的情況下進行，則具有較大的盲目性和隨機性，從而容易產(chǎn)生嚴重的近交衰退，導致繁殖率和存活率下降、后代適應能力降低、對疾病和災害的抵抗力減弱等現(xiàn)象；同時群體自由交配產(chǎn)生的后代其系譜信息難以確定，這些將導致后續(xù)人工增殖放流等工作難以開展。長鰭吻鮈親子鑒定技術的開發(fā)，是解決這些難題的有效途徑。目前關于長鰭吻鮈的研究主要集中在資源調(diào)查與評估、年齡與生長、生物學及遺傳多樣性等方面，未開展其親子鑒定技術研究工作。

目前無專門針對長鰭吻鮈的親子鑒定方法。微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱為簡單序列重復(Simple Sequence Repeat,SSR)是指一類重復單位在2～6個堿基的重復序列，微衛(wèi)星序列作為分子標記具有在真核基因組中廣泛分布、等位基因多雜合度高、擴增片段短擴增率高、靈敏度高于傳統(tǒng)的DNA指紋，結(jié)果可靠、方法簡單、省時省力等諸多優(yōu)點，在親子鑒定和遺傳多態(tài)性研究中微衛(wèi)星標記技術正在逐步取代其他分子標記技術。目前關于微衛(wèi)星親子鑒定技術的研究已廣泛應用于生命科學各個領域，其中包括一些水生生物，如凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、美洲牡蠣(Crassostrea virginica)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等親子鑒定分析。本發(fā)明利用微衛(wèi)星建立長鰭吻鮈親子鑒定技術可以用于指導長鰭吻鮈人工繁殖工作，有效防止近親交配或某些長鰭吻鮈親本過度繁殖所帶來的長鰭吻鮈種群遺傳多樣性的下降，使得長鰭吻鮈資源量得以較快恢復與增殖，從而更好的保護長鰭吻鮈。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供用于長鰭吻鮈親子鑒定的微衛(wèi)星熒光多重PCR引物組合，利用微衛(wèi)星標記與多重PCR技術結(jié)合，篩選了15對高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點，組建3-5個多重熒光PCR體系，與傳統(tǒng)PCR方法相比，本方法檢測的微衛(wèi)星位點提高了3倍左右，大大提高了親子鑒定的效率和速度。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定方法，用于長鰭吻鮈的親子鑒定、家系管理以及放流效果評估。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

用于長鰭吻鮈親子鑒定的微衛(wèi)星熒光多重PCR引物組合，包括引物組合B、引物組合C、引物組合D。