[發(fā)明專利]一種基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710091509.5
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN108410963B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱挺兵;陳亮;楊德國;朱永久;何勇鳳;吳興兵
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.用于長鰭吻鮈親子鑒定的微衛(wèi)星熒光多重PCR引物組合，包括引物組合B、引物組合C、引物組合D，其特征在于：引物組合B包括RVE-23、RVE-24、REN16，引物組合C包括RV-9、RV-7、REN10，引物組合D包括RV-8、REN30、REN34，各引物的序列及退火溫度、每對引物的正向引物5′端標(biāo)記的熒光物質(zhì)如下所示：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于長鰭吻鮈親子鑒定的微衛(wèi)星熒光多重PCR引物組合，其特征在于，還包括引物組合A或/和引物組合E，所述的引物組合A包括REN17、REN32、RVE-09，所述的引物組合E包括RVE-13、RVE-01、REN02，各引物的序列及退火溫度、每對引物的正向引物5′端標(biāo)記的熒光物質(zhì)如下所示：

3.一種基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定方法，其步驟是：

A.提取待檢測樣本的基因組DNA；

B.利用權(quán)利要求1或2所述的引物組合進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過測序儀進(jìn)行等位基因分型；

C.通過似然率檢測待測個體與親本基因型之間的相關(guān)性，確定親子關(guān)系。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于微衛(wèi)星熒光多重PCR的長鰭吻鮈親子鑒定方法，其特征在于，多重PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如下：

多重PCR組合A的PCR體系為總體積25μL，包括基因組DNA150ng，10×PCR Buffer 3μL，Mg²⁺1.8mM，dNTPs 0.4mM，rTaq DNA聚合酶2U，REN17、REN32、RVE-09正反引物各0.2μM，補充滅菌雙蒸水至25μL；PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53.8℃退火45s，72℃延伸1min，進(jìn)行33個循環(huán)；最后72℃再延伸10min，4℃保存；

多重PCR組合B的PCR體系中RVE-23、RVE-24、REN16正反引物各0.2μM，PCR反應(yīng)條件中退火溫度為59.2℃，其他均與多重PCR組合A的反應(yīng)體系及條件相同；

多重PCR組合C的PCR體系中RV-9、REN10正反引物各0.2μM，RV-7正反引物各0.28μM，PCR反應(yīng)條件中退火溫度為56.1℃，其他均與多重PCR組合A的反應(yīng)體系及條件相同；

多重PCR組合D的PCR體系中RV-8、REN30正反引物各0.2μM，REN34正反引物各0.28μM，PCR反應(yīng)條件中退火溫度為56.1℃，其他均與多重PCR組合A的反應(yīng)體系及條件相同；

多重PCR組合E的PCR體系中RVE-13、REN02正反引物各0.2μM，RVE-01正反引物各0.28μM，PCR反應(yīng)條件中退火溫度為51.9℃，其他均與多重PCR組合A的反應(yīng)體系及條件相同。