[發明專利]人KRAS基因多點突變單管聯檢熒光PCR方法、試劑盒及體系

有效

• 申請號: 201710090387.8
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106868127B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 黃臨迷;宋卓;袁夢兮
• 申請（專利權）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

技術領域

本發明涉及基因甲基化水平檢測技術領域，尤其涉及一種人KRAS基因多點突變單管聯檢熒光PCR方法、試劑盒及體系。

背景技術

糞便既含有脫落的正常結直腸上皮細胞和游離的DNA，也含有大量從結直腸癌上脫落的癌細胞和游離的癌DNA；又由于腸道是堿性環境，有利于DNA的保存，使從糞便中提取的DNA質量較好。因此糞便基因甲基化作為一種新的、敏感度高、特異性中等的無創性結直腸腫瘤標志物，能根據其陽性結果對疑似病例進行進一步檢測，作為相關腫瘤的早期篩查手段具有很重要的臨床價值。

石蠟組織切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構，還用于研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要手段，由于生物組織經過固定、石蠟包埋后能夠完好的保存其形態結構，大量的細胞內DNA遺傳物質得以完好保存在石蠟組織當中，經過脫蠟、細胞消化、DNA提取等步驟能夠將這些保存下來的DNA遺傳物質釋放出來。同時，石蠟組織切片也是一種短期內獲取大量人體新鮮組織標本的有效方式，且部分研究涉及回顧性分析，也需要借助于病理科等長期保存的福爾馬林固定石蠟包埋組織。因此，無論是作為相關腫瘤的早期篩查手段，還是從基因水平闡明腫瘤發病機制，石蠟切片組織都具有很重要的早期檢測、研究用臨床價值。

RAS基因家族與人類腫瘤密切相關的基因有三種HRAS、KRAS和NRAS，這三種基因編碼的蛋白質大約有90％的氨基酸序列同源，分子量均為21KDa，又稱為RASp21蛋白。KRAS信號通路是EGFR和其他信號轉導的下游通路，當RAS基因發生突變時，其編碼的RAS蛋白水解GTP-RAS能力下降，使得信號轉導通路一直處于持續激活狀態，刺激細胞不斷增殖分化，最終導致細胞惡變。KRAS突變基因是一種常見的致癌基因，多見于惡性腫瘤，結直腸癌患者中約有30％～40％存在KRAS基因突變，肺腺癌患者中約有15％～30％存在KRAS突變。KRAS突變主要定位在第12、13、61和63號密碼子，其中有7個突變熱點：Gly12Asp、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Cys、Gly12Ala、Gly12Arg和Gly13Asp共7類熱點突變，占KRAS基因總突變的90％以上。

研究表明，KRAS基因突變與NSCLC對吉非替尼、厄洛替尼等靶向治療藥物的原發性耐藥有關。有研究發現KRAS基因的突變使結直腸癌患者對西妥昔單抗的治療產生耐藥性。NCCN(非小細胞肺癌臨床實踐指南2016版)指出KRAS基因突變會使肺癌患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFT-TKI)產生耐藥；使結直腸癌患者對抗EGFR抗體類藥物產生耐藥。所以NCCN(非小細胞肺癌臨床實踐指南2016版)提出肺腺癌患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進行KRAS基因突變檢測，根據檢測結果決定是否使用EGFR靶向藥物作為臨床治療措施。因此對KRAS基因突變繼續風險預測，可作為EGFR靶向治療耐藥性產生與否的重要預測指標。

目前臨床檢測DNA中基因突變的方法主要有3種：1)直接測序法，是目前應用最多的一種檢測方法，主要是Sanger測序，當突變基因得到有效富集之后，才能被測序，優點是結果準確可靠，能讀取到被檢測序列信息，但其有效富集突變基因區域，及在突變基因含量低的情況下面臨極大的挑戰，一般用來確認其他檢測陽性結果。2)熒光定量PCR法，在熒光定量PCR平臺上，利用特異的引物對DNA突變靶序列進行PCR擴增，利用熒光標記探針對擴增產物進行突變檢測，這樣檢測方法特異性強、靈敏度高，可檢測到DNA含量低至1％的突變，但目前單管單一突變檢測通量低，探針成本昂貴，很難適應臨床大通量樣本的風險預測。3)高通量測序技術法，一般利用PCR技術對目標區域進行富集，然后構建適合于NGS上機測序的文庫，最后上機測序，信息分析獲得感興趣目標區域序列信息。但是在目前對目標區域富集過程中，富集的特異性和有效性在不同的實驗平臺差距大，而且普通的建庫流程繁雜，周期長，成本高，這些因素都造成是否需要進行高通量測序的限制因素。

因此，目前急需一種提高通量、結果判別快速清晰的各種生物樣本當中KRAS 基因突變進行風險預測的方法，為臨床提供是否需要進行進一步區分突變類型、或進行高通量測序提供判斷依據。

發明內容

本發明提供一種人KRAS基因多點突變單管聯檢熒光PCR方法、試劑盒及體系，在單管PCR反應中聯合檢測KRAS基因第12位和第13位密碼子上的7種熱點突變。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種人KRAS基因多點突變單管聯檢熒光PCR方法，包括：